秦嶺太白山南方紅豆杉組織培養(yǎng)條件研究

王鋒，秦靜遠，何高社

（楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程分院，陜西楊凌712100）

秦嶺太白山南方紅豆杉組織培養(yǎng)條件研究

王鋒，秦靜遠，何高社

（楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程分院，陜西楊凌712100）

研究不同采集時間、不同培養(yǎng)基以及不同植物生長調(diào)節(jié)劑對太白山南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)、生長的影響。結(jié)果表明，采集時間為5月，以1/2 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加NAA 1.0 mg/L，6-BA 0.5 mg/L的愈傷組織誘導(dǎo)效果好。

太白山；南方紅豆杉；組織培養(yǎng)

南方紅豆杉（Taxus chinensis var.mairei）又名美麗紅豆杉，為我國特有的第三紀孑遺植物，現(xiàn)主要分布于長江流域、南嶺山脈以及山西、陜西等省，現(xiàn)存資源很少，處于瀕危狀態(tài)，1992年被列為一級珍貴保護樹種[1]。

由于紅豆杉的提取物紫杉醇具有獨特的抗癌機理，美國科學(xué)家稱紫杉醇是繼阿霉素、順鉑以后，被認為是對多種癌癥療效好、副作用小的新型抗癌藥物。紫杉醇的市場開發(fā)、應(yīng)用潛力巨大，所以，紅豆杉的身價也因此倍增[2]。正因如此，我國的野生紅豆杉在短短的十幾年中遭到了史無前例的砍伐和破壞，野生存量銳減，有的地區(qū)甚至已瀕臨滅絕。因此，保護現(xiàn)有資源、人工擴大紅豆杉資源總量，就成為急需解決的問題，而常規(guī)的扦插、播種繁殖手段已不能滿足市場需要。植物組織培養(yǎng)技術(shù)為這一問題的解決提供了一條有效途徑。

當前對南方紅豆杉組織培養(yǎng)的研究主要集中在細胞培養(yǎng)和紫杉醇含量的影響因素上[3-5]，而營養(yǎng)器官組織培養(yǎng)再生植株方面的研究很少。本研究以太白山南方紅豆杉為培養(yǎng)材料，對不同培養(yǎng)基、不同采樣時間及不同外源激素組合對枝條離體快繁的影響進行研究，旨在為建立優(yōu)質(zhì)的南方紅豆杉種苗生產(chǎn)體系及快速繁殖優(yōu)良品種提供基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料采自秦嶺太白縣靖口鎮(zhèn)廟臺村，30 a樹齡南方紅豆杉的當年生嫩枝和前1 a長出的未萌發(fā)的休眠枝作為外植體。

1.2 外植體消毒和接種

將試驗材料先用流水沖洗40 min，加入少量洗潔精洗滌10 min，再用流水沖洗1 h。轉(zhuǎn)至超凈工作臺中用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3～4次。再用10%次氯酸鈉+洗潔精2滴，5月采集的嫩枝浸泡消毒15～16 min，8，11月采集的當年生嫩枝和前1 a長出的未萌發(fā)的休眠枝浸泡消毒18～20 min。

將浸泡次氯酸鈉消毒后的外植體用無菌水沖洗4～5次，轉(zhuǎn)移至無菌托盤上吸干水分，用剪刀剪取2.0～2.5 cm的莖段，每莖段帶1～2個腋芽，以形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基，每瓶接種2～3段。培養(yǎng)條件為光照12 h/d，光照強度1 500 lx，溫度（24±1）℃。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 基本培養(yǎng)基篩選分別以1/2 MS，MS，B5為基本培養(yǎng)基[6-9]，加入6-BA 0.5 mg/L和NAA 1 mg/L，篩選出最佳培養(yǎng)基。

1.3.2 采集時間對外植體生長和愈傷組織誘導(dǎo)的影響分別于5，8，11月采集30 a樹齡南方紅豆杉的當年生嫩枝和前1 a長出的未萌發(fā)的休眠枝作為外植體，接種在3種基本培養(yǎng)基上，分析采集時間對外植體生長和愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.3.3 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響

在篩選出的基本培養(yǎng)基上，分別添加不同濃度的NAA，2，4-D，6-BA，分析其對外植體生長和愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

接種后每日記錄外植體發(fā)育情況，統(tǒng)計初愈時間（每處理重復(fù)中第1塊外植體長出愈傷組織所需時間），計算愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織外植體個數(shù)/（接入外植體個數(shù)-被污染外植體個數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基篩選結(jié)果

外植體在1/2 MS，MS和B5這3種培養(yǎng)基上培養(yǎng)結(jié)果表明，誘導(dǎo)率由大到小的順序為1/2 MS＞MS＞B5；初愈時間先后排序為1/2 MS，B5，MS（表1）。因此，選1/2 MS為最適基本培養(yǎng)基。

表1 外植體愈傷組織誘導(dǎo)情況

2.2 采集時間對外植體生長和愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表1可以看出，5月采集的最好，誘導(dǎo)率高，初愈時間短；11月采集的較好；8月采集的最差。

2.3 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響

為研究不同激素種類及水平對愈傷組織誘導(dǎo)的影響，選取了11種不同組合激素處理（表2）進行研究。結(jié)果顯示，在NAA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L，6-BA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L（處理4）時，愈傷組織誘導(dǎo)效果優(yōu)于其他激素組合處理。在只添加2 mg/L 2，4-D（處理11）的培養(yǎng)基中，其愈傷組織誘導(dǎo)率也遠高于除處理4，10以外的其他處理，生長狀態(tài)及速度也較好。結(jié)果表明，NAA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L，6-BA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時，對愈傷組織的誘導(dǎo)和生長有顯著影響。

表2 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)論與討論

通過基本培養(yǎng)基的篩選，1/2 MS培養(yǎng)基是太白山南方紅豆杉莖段培養(yǎng)最適的培養(yǎng)基。本試驗中，1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的外植體愈傷組織誘導(dǎo)率高，小苗健壯，褐化程度輕。而在MS和B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)率較低，小苗瘦弱，褐化程度較高。MS培養(yǎng)基較B5培養(yǎng)基效果好一些，這與蘇應(yīng)娟等[6-7]的研究結(jié)果一致。1/2 MS培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上對無機鹽成分減半，有機成分不變，褐化程度較輕與此有關(guān)。據(jù)報道，降低鹽濃度可以減少酚類外溢，從而減輕褐變[10-13]。

對不同采集時間對外植體生長和愈傷組織誘導(dǎo)的影響研究表明，3個不同月份采集的外植體中，5月采集效果最好，與已報道的是一致的[14]。這可能與樹體本身的生理狀態(tài)和芽的休眠度有關(guān)。

在以1/2 MS為基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加NAA 1.0 mg/L，6-BA 0.5 mg/L的愈傷組織誘導(dǎo)效果好。同時，2，4-D的單獨使用，效果也很明顯，但有報道認為，2，4-D本身具有致癌活性，不適用于作為藥源的南方紅豆杉組織培養(yǎng)，適宜濃度的NAA可以替代2，4-D[15]。

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Study on Tissue Culture of Taxus chinensis var.mairei of Taibai Mountain in Qinling Mountains

WANGFeng，QINJingyuan，HE Gaoshe
（School ofBioengineering，Yangling Vocational&Technical College，Yangling 712100，China）

The paper studied the influence of different sampling time,different medium,different kinds and concentrations of plant growth regulators on induction,growth of Taxus chinensis var.mairei.The results showed that selecting the shoots as explants in May was suitable.1/2 MS medium containing NAA 1.0 mg/L and 6-BA 0.5 mg/Lcombination was applicable to induce callus out,and grewwell.

Taibai Mountain;Taxus chinensis var.mairei;tissues culture

S791.49

：A

：1002-2481（2017）07-1072-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.07.07

2017-01-19

楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院科學(xué)研究基金項目（A2013001）

王鋒（1982-），男，陜西延川人，講師，碩士，主要從事植物生產(chǎn)和生物發(fā)酵等方面的教學(xué)研究工作。