乳腺癌內(nèi)分泌治療對(duì)髓系抑制性細(xì)胞的影響

毛啟新，孫亞冬，張崇建，劉山青，李永，申衍，李連方

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科，鄭州4500080

中國(guó)乳腺癌的發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重影響患者的健康。免疫微環(huán)境對(duì)于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要的影響，其中髓系抑制性細(xì)胞（myeloidderived suppressor cell，MDSC）因其免疫抑制作用、固有性影響和適應(yīng)性免疫反應(yīng)引起較大關(guān)注，報(bào)道較多[1-2]。作為重要的全身治療方法之一，內(nèi)分泌治療在雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性和（或）孕激素受體（progesterone receptor，PR）陽(yáng)性乳腺癌患者術(shù)后輔助治療、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療和術(shù)前新輔助治療中發(fā)揮重要的作用[3-4]。既往文獻(xiàn)報(bào)道，無(wú)論是選擇性ER調(diào)節(jié)劑他莫昔芬，還是芳香化酶抑制劑來(lái)曲唑，均可影響腫瘤微環(huán)境中的特定免疫成分[5-6]，但對(duì)于MDSC的作用尚缺乏報(bào)道。因此，本研究分析了乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物對(duì)MDSC的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年8月至2016年8月于鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受術(shù)后輔助治療的53例乳腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診為乳腺癌；②接受過(guò)乳腺癌改良根治手術(shù)或保乳手術(shù)治療；③術(shù)后均接受過(guò)蒽環(huán)序貫紫杉類藥物化療；④術(shù)后病理免疫組織化學(xué)檢測(cè)ER和（或）PR陽(yáng)性，需接受內(nèi)分泌治療；⑤對(duì)本研究知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者不能配合研究。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入53例患者，均為女性；年齡為42～82歲，平均年齡為（57.28±10.48）歲；腫瘤直徑為1.29～9.04 cm，平均腫瘤直徑為（4.52±1.59）cm；陽(yáng)性腋窩淋巴結(jié)數(shù)量為1～6枚，平均數(shù)量為（3.25±1.27）枚。采用簡(jiǎn)單隨機(jī)化分組法將53例患者隨機(jī)分為他莫昔芬組（他莫昔芬治療）22例和來(lái)曲唑組（來(lái)曲唑治療）31例。他莫昔芬組患者的平均年齡為（59.86±11.85）歲；平均腫瘤直徑為（4.56±1.89）cm；平均陽(yáng)性腋窩淋巴結(jié)數(shù)量為（3.50±1.26）枚；病理類型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌15例，浸潤(rùn)性小葉癌5例，其他2例；臨床分期：0～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期6例。來(lái)曲唑組患者的平均年齡為（55.45±9.15）歲；平均腫瘤直徑為（4.49±1.37）cm；平均陽(yáng)性腋窩淋巴結(jié)數(shù)量為（3.06±1.26）枚；病理類型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌22例，浸潤(rùn)性小葉癌7例，其他2例；臨床分期：0～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期8例。兩組患者的平均年齡、平均腫瘤直徑、平均陽(yáng)性腋窩淋巴結(jié)數(shù)量、病理類型、臨床分期比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)備案。

1.2 治療方法

根據(jù)中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范（2017年版）[7]，對(duì)ER和（或）PR陽(yáng)性的患者應(yīng)用內(nèi)分泌藥物進(jìn)行治療，藥物包括他莫昔芬（10 mg，口服，每天2次）和來(lái)曲唑（2.5 mg，口服，每天1次）。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)及分選MDSC

抽取入組患者內(nèi)分泌治療前外周血進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，確定基線數(shù)據(jù)；內(nèi)分泌治療6個(gè)月后，再次檢測(cè)外周血MDSC，從而明確他莫昔芬和來(lái)曲唑?qū)θ橄侔┗颊進(jìn)DSC數(shù)量和功能的影響。應(yīng)用氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞，離心后移除上層清液，使用Hanks液重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整濃度至2×107/ml。將50 μl細(xì)胞懸液與熒光抗體混勻，暗室低溫孵育30 min，Hanks液游離抗體后上機(jī)檢測(cè)或分選。檢測(cè)或分選MDSC所用流式熒光抗體均購(gòu)于美國(guó)BD公司，包括APC-CD33、Pacific blue-CD45和Per-CP-CY5.5-HLA-DR。

1.4 MDSC功能鑒定

應(yīng)用體外培養(yǎng)體系分析MDSC對(duì)T細(xì)胞增殖的影響。常溫環(huán)境中，應(yīng)用羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（carboxfluorescencein diacetate succinimidyl ester，CFSE）標(biāo)記外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），反應(yīng)10 min后Hanks液洗滌。已標(biāo)記的PBMC接受植物凝集素（phytohemagglutinin，PHA）刺激，單獨(dú)培養(yǎng)或與分選獲得的MDSC共培養(yǎng)72 h。未加MDSC即為陽(yáng)性對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，依據(jù)CFSE熒光強(qiáng)度判斷T細(xì)胞的增殖程度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血MDSC相對(duì)數(shù)、絕對(duì)數(shù)比較

內(nèi)分泌治療前，他莫昔芬組與來(lái)曲唑組患者的MDSC相對(duì)數(shù)、絕對(duì)數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療6個(gè)月后，他莫昔芬組與來(lái)曲唑組患者的MDSC相對(duì)數(shù)、絕對(duì)數(shù)均明顯低于本組治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.623、18.883，P＜0.01；t=14.614、14.496，P＜0.01）；治療6個(gè)月后，來(lái)曲唑組患者的MDSC相對(duì)數(shù)、絕對(duì)數(shù)均明顯低于他莫昔芬組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.477、3.539，P＜0.01）。（表1）

表1 兩組患者內(nèi)分泌治療前及治療 6個(gè)月后外周血MDSC的相對(duì)數(shù)、絕對(duì)數(shù)（± s）

表1 兩組患者內(nèi)分泌治療前及治療 6個(gè)月后外周血MDSC的相對(duì)數(shù)、絕對(duì)數(shù)（± s）

images/BZ_80_1292_1754_2246_1799.png相對(duì)數(shù)（%）絕對(duì)數(shù)（×106/ml）治療前治療6個(gè)月后治療前治療6個(gè)月后14.95±5.20 9.65±3.50 7.59±3.34 2.92±1.18 14.77±6.36 3.09±1.91 8.89±3.10 1.73±0.35）

2.2 T細(xì)胞增殖水平比較

他莫昔芬組與來(lái)曲唑組患者的外周血經(jīng)MDSC處理后的CD3+T細(xì)胞的增殖水平分別為（30.25±4.94）%和（65.93±17.48）%，均明顯低于本組未加MDSC的（73.98±10.58）%和（76.48±10.65）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=36.376、8.600，P＜0.01）；來(lái)曲唑組患者的外周血經(jīng)MDSC處理后的CD3+T細(xì)胞的增殖水平明顯高于他莫昔芬組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.694，P＜0.01）；兩組未加MDSC的CD3+T細(xì)胞的增殖水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

在世界范圍內(nèi)，乳腺癌已成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。作為乳腺癌全身治療的重要方法之一，內(nèi)分泌治療從20世紀(jì)70年代起用于臨床腫瘤治療，現(xiàn)階段可用于乳腺癌術(shù)后輔助治療、術(shù)前新輔助治療及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療。主要治療藥物包括他莫昔芬和芳香化酶抑制劑（阿那曲唑、來(lái)曲唑及依西美坦等），目前主要依據(jù)患者的月經(jīng)情況選擇藥物。內(nèi)分泌治療可明顯延長(zhǎng)ER和（或）PR陽(yáng)性乳腺癌患者的生存期并提高生活質(zhì)量，但相當(dāng)比例的患者仍出現(xiàn)疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響預(yù)后。在此過(guò)程中，自身免疫抑制發(fā)揮了重要作用，涉及多種固有性和獲得性免疫系統(tǒng)組成成分[8-10]。本研究重點(diǎn)探討常用的內(nèi)分泌治療藥物對(duì)于具有免疫調(diào)節(jié)功能的MDSC的影響，結(jié)果提示他莫昔芬和來(lái)曲唑均可減少乳腺癌患者外周血MDSC的相對(duì)數(shù)及絕對(duì)數(shù)，并抑制其免疫抑制功能；兩組比較，來(lái)曲唑作用更為顯著。

腫瘤免疫微環(huán)境不僅包含效應(yīng)性成分，抑制惡性腫瘤細(xì)胞局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，還包含調(diào)節(jié)性成分，抑制效應(yīng)性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致疾病進(jìn)展[11]。此類研究既往主要圍繞調(diào)節(jié)性T細(xì)胞進(jìn)行，而近年來(lái)MDSC成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的另一研究熱點(diǎn)。MDSC為一類異質(zhì)性髓系細(xì)胞亞群，由各階段前體細(xì)胞和祖細(xì)胞共同構(gòu)成[12]。粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等成熟髓系細(xì)胞由造血干細(xì)胞分化形成，多種病理過(guò)程均可抑制髓系細(xì)胞正常分化，導(dǎo)致造血干細(xì)胞異常分化，從而產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)功能的MDSC[13]。小鼠中，MDSC表達(dá)細(xì)胞表面分子CD11b和Gr1；而人體內(nèi)MDSC缺乏特異性鑒定標(biāo)志物，通常定義為同時(shí)表達(dá)CD11b和CD33的髓系細(xì)胞，同時(shí)不表達(dá)或低表達(dá)HLA-DR[14]。MDSC對(duì)多種免疫細(xì)胞有抑制作用，其中對(duì)T細(xì)胞的影響最為顯著，可明顯降低其增殖水平和分泌功能。MDSC參與腫瘤微環(huán)境的形成與維持，有助于乳腺癌細(xì)胞的免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Miky?ková等[15]發(fā)現(xiàn)，MDSC 水平與外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，晚期乳腺癌患者外周血MDSC水平明顯高于早期患者，且MDSC與患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果提示MDSC水平及功能與腫瘤負(fù)荷有關(guān)，可作為新型生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)患者的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和評(píng)估預(yù)后。

對(duì)于藥物與乳腺癌MDSC的相互作用，國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道。Kusmartsev等[14]利用荷瘤小鼠模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸通過(guò)直接抗腫瘤作用和抑制集落刺激因子釋放的間接機(jī)制影響MDSC的分化和腫瘤內(nèi)蓄積。Miky?ková等[15]檢測(cè)環(huán)磷酰胺處理后的MDSC的免疫抑制功能，結(jié)果顯示MDSC的免疫抑制功能顯著提高，提示環(huán)磷酰胺對(duì)MDSC具有誘導(dǎo)作用。在荷瘤小鼠模型中應(yīng)用舒尼替尼可明顯減少脾臟MDSC數(shù)目，有助于免疫重塑[16]。雷帕霉素對(duì)MDSC的誘導(dǎo)[16]和抑制[17]作用均有文獻(xiàn)支持，尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論。由此可見(jiàn)，不同藥物對(duì)MDSC的影響差異較大，且非人體試驗(yàn)數(shù)據(jù)，無(wú)法指導(dǎo)臨床用藥。本研究進(jìn)行臨床觀察性試驗(yàn)，在國(guó)內(nèi)尚屬首次，具有較大學(xué)術(shù)創(chuàng)新意義和臨床推廣價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物他莫昔芬和來(lái)曲唑均可抑制MDSC的擴(kuò)增和激活，減少M(fèi)DSC數(shù)量及抑制其功能。上述兩種藥物已成為最為常見(jiàn)的乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物，之前研究主要從殺傷腫瘤細(xì)胞的能力和降低不良反應(yīng)的發(fā)生率方面比較不同藥物的優(yōu)劣，為臨床決策提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。本研究結(jié)果顯示，相對(duì)于他莫昔芬，來(lái)曲唑具有更顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，以及抑制MDSC聚集及其功能的作用，重塑免疫微環(huán)境可能對(duì)于腫瘤的控制具有積極的意義，最終延長(zhǎng)患者生存期，提高生活質(zhì)量。圍繞他莫昔芬和來(lái)曲唑等藥物對(duì)MDSC的調(diào)節(jié)機(jī)制，結(jié)合上述文獻(xiàn)，提出假設(shè)，內(nèi)分泌治療藥物可能會(huì)直接抑制MDSC擴(kuò)增及激活，或通過(guò)相關(guān)細(xì)胞因子間接作用，誘導(dǎo)MDSC內(nèi)自噬和凋亡水平升高。在接下來(lái)的工作中，計(jì)劃借助離體細(xì)胞或整體動(dòng)物模型對(duì)此加以研究和分析。綜上所述，對(duì)于乳腺癌術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療患者，他莫昔芬和來(lái)曲唑均可明顯減少患者外周血MDSC的數(shù)量，并降低其功能，而兩者相比，來(lái)曲唑的作用更為顯著。這將拓展對(duì)乳腺癌腫瘤微環(huán)境的理解，并為治療藥物的精準(zhǔn)選擇提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。