2株產(chǎn)低溫蛋白酶耐冷菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)

徐曉梅 薛雙紅 袁俊超 鄭連爽 熊燕飛++張建坤+蘇寶連+謝浩

摘要：采用低溫液體富集、酪蛋白篩選平板、溫度復(fù)篩等方法從黑龍江省大慶油田土壤這一非極端自然環(huán)境中篩選分離獲得2株產(chǎn)低溫蛋白酶的耐冷細(xì)菌LS3和LS4，通過(guò)菌落形態(tài)和顯微觀察，結(jié)合16S rDNA全序列分析確定前者為假單胞菌屬（Pseudomonas），后者為微小桿菌屬（Exiguobacterium）。LS3和LS4菌株在低溫（10 ℃）下均能較好地生長(zhǎng)及產(chǎn)酶，最適酶活溫度分別為40、30 ℃，最適作用pH值均為8，對(duì)熱敏感，低溫仍能維持較好的酶活，屬于低溫堿性蛋白酶。其中，LS3菌株在含尿素培養(yǎng)基中產(chǎn)酶活性較高（52.46 U/mL），LS4菌株產(chǎn)的蛋白酶對(duì)鹽有一定耐受性。本研究結(jié)果豐富了對(duì)低溫蛋白酶的研究開(kāi)發(fā)，為其在食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)復(fù)合菌劑等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：耐冷菌株；低溫蛋白酶；酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)：S182；Q814.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0209-04

微生物的生命活動(dòng)和溫度密切相關(guān)，可分為高溫、中溫和低溫微生物三大類。Morita將低溫微生物分為嗜冷菌（psychophile）和耐冷菌（psychrotroph），前者最低可低于0生長(zhǎng)，最高生長(zhǎng)溫度約20 ℃，最適生長(zhǎng)溫度不超過(guò)15 ℃；后者最適溫度可高于15 ℃，最高生長(zhǎng)溫度大于20 ℃，在0～5 ℃可生長(zhǎng)繁殖[1]，該定義已被廣泛接受。James等在《Modern Food Microbiology》一書中提出，耐冷菌又有狹義（stenopsychrotroph，40 ℃不生長(zhǎng)）和廣義（eurypsychrotroph，可高于40 ℃生長(zhǎng)）之分[2-3]。這些低溫微生物是低溫酶（cold-active enzyme or psychrophilic enzyme）來(lái)源的重要資源庫(kù)。蛋白酶是目前應(yīng)用最多的一種酶，占世界酶市場(chǎng)的60%以上[4]。低溫蛋白酶最適作用溫度一般比同功能的中溫蛋白酶（50 ℃）低20～30 ℃，在低溫（0～20 ℃）和中溫環(huán)境下均具有較高催化活性，且對(duì)熱不穩(wěn)定，因而有著中溫蛋白酶無(wú)法取代的優(yōu)越性[5]，已被廣泛應(yīng)用于分子生物技術(shù)、環(huán)境生物修復(fù)、食品工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)等各大領(lǐng)域[6]。已報(bào)道的產(chǎn)低溫蛋白酶的微生物大多分離自兩極、深海、冰川、凍土等常冷環(huán)境[7-10]。本研究對(duì)大慶油田土壤樣品中微生物進(jìn)行分離篩選，得到2株產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的耐冷菌，即狹義耐冷菌LS3和廣義耐冷菌LS4，經(jīng)鑒定分別屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）和微小桿菌（Exiguobacterium sp.），并進(jìn)一步對(duì)粗酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，為低溫蛋白酶的廣泛應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株來(lái)源及培養(yǎng)基

1.1.1菌株來(lái)源

土壤樣品來(lái)自黑龍江省大慶油田，為無(wú)結(jié)核硅質(zhì)黏土，顏色較黑，質(zhì)地較硬。

1.1.2培養(yǎng)基

（1）LB富集培養(yǎng)基。蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，調(diào)pH值至7.0～7.2。固體培養(yǎng)基另加15～20 g/L瓊脂粉。（2）初篩培養(yǎng)基。酪蛋白 10 g/L，蛋白胨0.5 g/L，酵母提取物0.3 g/L，瓊脂粉1.5%～2.0%，調(diào)pH值至7.0～8.0。（3）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。酪蛋白10 g/L，蛋白胨0.5 g/L，酵母提取物0.3 g/L，調(diào)pH值至 7.0～8.0。

1.2產(chǎn)低溫蛋白酶耐冷菌株的篩選及鑒定

1.2.1耐冷菌富集5 g土壤樣品加入45 mL無(wú)菌水，充分?jǐn)嚢韬箪o置30 min浸出，取土壤浸出液于LB培養(yǎng)基中，于 10 ℃、130 r/min富集培養(yǎng)并如此轉(zhuǎn)接富集3～4次，以上所有過(guò)程均在無(wú)菌條件下完成。

1.2.2產(chǎn)低溫蛋白酶耐冷菌株初篩將富集菌液按梯度稀釋法取合適稀釋度移入初篩平板中，涂布均勻，10 ℃倒置培養(yǎng)，挑選透明圈較大、菌落直徑較大的菌株繼續(xù)涂布或劃線直至菌落形狀完全一致。

1.2.3產(chǎn)低溫蛋白酶耐冷菌株溫度復(fù)篩以43 ℃為生長(zhǎng)上限溫度，該溫度下即不生長(zhǎng)的菌株為耐冷菌，如前所述40 ℃用于區(qū)分狹義和廣義耐冷菌[2-3]。將初篩得到的產(chǎn)蛋白酶菌株在初篩平板上點(diǎn)樣，分別置于4、20、37、43 ℃上培養(yǎng)，4 ℃生長(zhǎng)、43 ℃下不生長(zhǎng)的菌株為試驗(yàn)菌株，液體培養(yǎng)后加滅菌甘油于-70 ℃下保存。

1.2.4蛋白酶活力測(cè)定按照QB/T 1803—1993《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》的紫外分光光度法測(cè)定粗酶液酶活力。20 g/L 酪蛋白底物用pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液配制，相應(yīng)溫度下反應(yīng)30 min后加0.4 mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，275 nm處測(cè)定吸光度D值。酶活力定義為：在上述條件下，1 mL酶液催化酪蛋白水解形成1 μg酪氨酸的酶量為1個(gè)單位（U/mL）。

1.2.516S rDNA全序列測(cè)序細(xì)菌克隆測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。通用引物為：7F，5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；1540R，5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。

1.3菌株生長(zhǎng)產(chǎn)酶特性

1.3.1溫度對(duì)產(chǎn)酶耐冷菌生長(zhǎng)的影響將產(chǎn)酶菌株的液體培養(yǎng)液按2%的接種量接入10 mL LB富集培養(yǎng)基中，分別置于4、10、20、25、30、37、40、43 ℃下130 r/min下振蕩培養(yǎng)，每隔 2 h 測(cè)其D600 nm值。

1.3.2pH值對(duì)產(chǎn)酶耐冷菌生長(zhǎng)的影響同“1.3.1”節(jié)接種，于30 ℃、130 r/min下振蕩培養(yǎng)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值分別為5、6、7、8、9，每隔2 h測(cè)其D600 nm值。

1.3.3鹽度對(duì)產(chǎn)酶耐冷菌生長(zhǎng)的影響同“1.3.2”節(jié)接種培養(yǎng)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基NaCl濃度分別為0、5、10、20、30、40、50、60、70 g/L，每隔2 h測(cè)其D600 nm值。

1.3.4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶影響將產(chǎn)酶菌株的液體培養(yǎng)液按2%的接種量接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于 10 ℃、130 r/min下振蕩培養(yǎng)，每24 h測(cè)其D600 nm 值及上清液酶活力。

1.3.5不同碳源、氮源對(duì)耐冷菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶影響

1.3.5.1碳源試驗(yàn)以酪蛋白為氮源，在培養(yǎng)基中分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉和酵母膏為碳源，使終濃度為10 g/L，培養(yǎng)96 h后測(cè)酶活力。

1.3.5.2氮源試驗(yàn)以酵母膏為碳源，在培養(yǎng)基中分別加入胰蛋白胨、尿素、氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨和酪蛋白為氮源，使終濃度為5 g/L，培養(yǎng)96 h后測(cè)上清液酶活力。

1.4粗酶液部分酶學(xué)性質(zhì)研究

1.4.1酶的最適溫度將酶活力測(cè)定中的反應(yīng)溫度分別控制在10、20、30、40、50、60 ℃，其他條件不變，分別測(cè)定酶活力。

1.4.2酶的最適pH值在最適反應(yīng)溫度下，將酶活力測(cè)定中的反應(yīng)pH值分別控制在7、8、9、10、11，其他條件不變，分別測(cè)定酶活力。

1.4.3酶的熱穩(wěn)定性將粗酶液分別在30、40、50、60 ℃ 等4個(gè)溫度下保溫10、20、30、40 min，再放入冰水混合物中冷卻，測(cè)定蛋白酶活力，以未做保溫處理的酶活力為對(duì)照。

1.4.4酶的耐鹽性在酶的最佳反應(yīng)溫度和pH值條件下，于酶反應(yīng)體系中分別加入0、10、20、30、40、50 g/L NaCl，以未加NaCl的酶活力為100%，分別測(cè)定酶活力。

1.4.5部分金屬離子及抑制劑對(duì)酶活力的影響在酶的最佳反應(yīng)溫度和pH值條件下，于酶反應(yīng)體系中加入不同金屬離子及抑制劑，以未加金屬離子或抑制劑的酶活力為100%，測(cè)定加入化學(xué)劑后的酶活力。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)低溫蛋白酶耐冷菌株的篩選和鑒定

經(jīng)過(guò)低溫富集、平板初篩、溫度復(fù)篩及酶活力檢測(cè)，從土壤樣品中篩選得產(chǎn)蛋白酶活力較高的耐冷菌LS3和LS4。LS3菌株呈細(xì)長(zhǎng)桿狀，長(zhǎng)約2 μm，寬約0.5 μm；LS4菌株呈粗短桿狀，長(zhǎng)不到1 μm，寬約0.8 μm（圖1）。在酪蛋白平板上，兩菌均呈圓形，不透明，表面光滑、邊緣整齊、易挑取，產(chǎn)生明顯透明圈，其中LS3為乳白色，LS4呈土黃色。經(jīng)16S rDNA [CM（23*5]全序列測(cè)序鑒定，乳白色LS3菌株為假單胞菌屬，土黃

色LS4菌株為微小桿菌屬。

2.2菌株生長(zhǎng)產(chǎn)酶特性

2.2.1溫度、pH值及鹽濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響2株菌株在不同溫度、pH值及鹽濃度培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況不同。LS3和LS4在低溫（4、10 ℃）下生長(zhǎng)狀態(tài)較好，LS3在33 ℃不生長(zhǎng)，符合狹義耐冷菌的定義，而LS4在43 ℃下不生長(zhǎng)，為廣義耐冷菌。2株菌株對(duì)pH值均有一定耐受性，LS3在pH值為6～8之間生長(zhǎng)良好，LS4在pH值為5～8之間生長(zhǎng)良好，pH值達(dá)到9時(shí)對(duì)2株菌株生長(zhǎng)稍有不利。LS3在0～20 g/L鹽濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)狀態(tài)良好，在鹽濃度超過(guò)30 g/L以后隨著鹽度升高，菌株生長(zhǎng)逐漸受到抑制，當(dāng)鹽濃度為50 g/L時(shí)即不生長(zhǎng)，在60 g/L以上時(shí)D值呈下降趨勢(shì)，因?yàn)樵谠摋l件下，耐冷菌受到高滲脅迫，胞內(nèi)失水，細(xì)胞凋亡。LS4菌株的耐鹽性與LS3相似，但其在不含鹽條件下生長(zhǎng)也會(huì)受到抑制，在鹽濃度為50 g/L時(shí)也能生長(zhǎng)，只是在高鹽環(huán)境下生長(zhǎng)受阻而十分緩慢。

2.2.2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響2株菌株在 10 ℃ 下生長(zhǎng)和產(chǎn)蛋白酶曲線（酶反應(yīng)溫度為10 ℃）結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，2株菌株在60 h前處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，后進(jìn)入一段較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定期，且酶活力在達(dá)到穩(wěn)定期之前呈直線上升趨勢(shì)，之后也漸趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)液中蛋白酶量與菌體生物量呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期時(shí)，菌株開(kāi)始大量合成蛋白酶并分泌至胞外，隨后酶繼續(xù)產(chǎn)生，培養(yǎng)液中酶活力迅速升高；當(dāng)菌體生長(zhǎng)達(dá)穩(wěn)定期后，培養(yǎng)液中酶活力保持基本恒定，并能維持較長(zhǎng)時(shí)間。

2.2.3不同碳源和氮源對(duì)耐冷菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響利用不同碳源和氮源對(duì)LS3與LS4等2株耐冷菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況分別見(jiàn)表1、表2。由表1可知，2株菌株均不能在含葡萄糖的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；對(duì)麥芽糖和可溶性淀粉利用率很低，酶活力極低或沒(méi)有酶活力；能較好地利用蔗糖，且有較高酶活力；在含酵母膏的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最旺盛，但就酶活力而言，LS3菌株利用酵母膏的產(chǎn)酶情況不及蔗糖，LS4菌株利用酵母膏和蔗糖的產(chǎn)酶情況相當(dāng)。由表2可知，在所試7種氮源中，LS4菌株雖能利用不同氮源生長(zhǎng)，但僅在酪蛋白的存在下才產(chǎn)生蛋白酶，可認(rèn)為其分泌的蛋白酶是誘導(dǎo)酶而非組成酶。LS3菌株與LS4菌株相似，但除了酪蛋白，其還能更好地利用尿素分泌蛋白酶，酶活力達(dá)到 52.46 U/mL。

2.3粗酶液部分的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1酶的最適溫度設(shè)置不同的溫度梯度，對(duì)菌株酶活力進(jìn)行檢測(cè)。圖3顯示，狹義耐冷菌LS3產(chǎn)蛋白酶的最適作用溫度約在40 ℃，50 ℃仍維持95%左右的酶活力，而在60 ℃降到50%左右，且在10、20 ℃維持較高酶活力，分別為40%、55%左右。廣義耐冷菌LS4產(chǎn)蛋白酶的最適作用溫度較LS3的低，在30 ℃左右，在10、20 ℃下分別維持45%、60%左右的較高酶活力，60 ℃高溫下僅存最高酶活力的25%左右。根據(jù)Margesin等的定義，通常把最適作用溫度在35 ℃左右的低溫下仍具一定催化效率的酶稱為低溫酶[11]。已報(bào)道的由耐冷菌分泌的蛋白酶最適作用溫度一般處在25～50 ℃范圍[12]。已知耐冷菌產(chǎn)蛋白酶的最適作用溫度最低的為19℃[13]，也有更高的最適溫度（55～60 ℃）[14-16]，可視為中溫酶。由此表明，耐冷菌所產(chǎn)酶不一定都是低溫酶，要鑒定是否為產(chǎn)低溫蛋白酶的菌株，也須要比較所產(chǎn)蛋白酶在不同溫度下的酶活力以及酶的熱穩(wěn)定性。

2.3.2酶的最適pH值設(shè)置不同的pH值梯度，對(duì)菌株酶活力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。2株菌株最適作用pH值均在8左右，LS3菌株所產(chǎn)蛋白酶在堿性環(huán)境（pH值為8～11）下維持較高酶活力，雖呈遞減趨勢(shì)，但pH值在11時(shí)仍保持最高酶活力的60%左右。而LS4菌株所產(chǎn)蛋白酶活力受pH值影響較大，隨pH值升高，酶活力迅速下降，pH值為11時(shí)僅為最高酶活力的15%左右。2株菌株所產(chǎn)低溫蛋白酶均為堿性蛋白酶。

2.3.3酶的熱穩(wěn)定性蛋白酶的耐熱性檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果顯示，LS3和LS4等2株菌株所產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)熱的穩(wěn)定性不同（圖5）。30 ℃保溫處理對(duì)LS3菌株產(chǎn)生的蛋白酶影響不大，該溫度下保溫40 min后仍持有65%左右的活性；40 ℃處理30 min，50 ℃保溫10 min后仍保持60%左右，但50 ℃處理 20 min 則幾乎喪失100%的酶活力。相對(duì)LS3而言，LS4菌株產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)熱更不穩(wěn)定，其在30 ℃保溫30 min之后即喪失45%左右的活力，40 min后僅剩30%左右；40 ℃保溫 10 min 之后則只剩50%左右的酶活力，40 ℃處理30 min，50 ℃ 處理10 min即喪失所有酶活力。LS3和LS4等2株菌株產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，應(yīng)該與酶的最適作用溫度有關(guān)，前者為40 ℃左右，后者約為30 ℃，所以LS4菌株產(chǎn)生的蛋白酶熱穩(wěn)定性更差?？偠灾?株菌株所產(chǎn)生的蛋白酶均對(duì)熱不穩(wěn)定，在較高溫度（>50 ℃）下可快速失活，這是低溫酶的一個(gè)重要特性。

2.3.4酶的耐鹽性由圖6可知，鹽濃度對(duì)蛋白酶活力影響較為明顯，尤其是對(duì)LS3菌株產(chǎn)生的蛋白酶而言，鹽濃度為10 g/L時(shí)即可抑制50%左右的酶活力，鹽濃度為30 g/L時(shí)幾乎喪失100%的酶活力。LS4菌株產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)鹽有一定耐受能力，鹽濃度為10 g/L時(shí)仍保持70%左右的酶活力，鹽濃度為40 g/L時(shí)保持15%左右的酶活力。

2.3.5部分金屬離子及抑制劑對(duì)酶活力的影響金屬離子對(duì)酶活力的影響與酶的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)，研究金屬離子對(duì)酶活力的影響在今后的理論及應(yīng)用研究中都具有重要的意義。由表3可知，受試金屬離子對(duì)LS3菌株產(chǎn)蛋白酶的活力均有一定程度的抑制作用，Mg2+、K+、Ba2+濃度的抑制作用沒(méi)有Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+濃度的抑制作用明顯，而Mg2+、K+濃度對(duì)LS4菌株產(chǎn)生的蛋白酶無(wú)明顯影響，Cu2+、Zn2+濃度則會(huì)[CM（25]使蛋白酶完全失活。吐溫80對(duì)2個(gè)蛋白酶均有明顯的激

活效果，其中機(jī)理尚不清楚。已有研究表明，吐溫80可在蛋白藥物中用作穩(wěn)定劑，起保護(hù)作用，防止蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生反應(yīng)或吸附聚集[17]。變性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）對(duì)2株菌株的蛋白酶均有強(qiáng)烈的抑制作用，使蛋白酶的氫鍵、疏水鍵打開(kāi)并插入其疏水內(nèi)部，形成蛋白酶-SDS復(fù)合物，從而使酶失活。研究表明，二甲基亞砜（DMSO）存在一定的毒性作用，與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)發(fā)生作用，能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。然而試驗(yàn)顯示，DMSO對(duì)蛋白酶無(wú)抑制作用且對(duì)LS4菌株產(chǎn)生的蛋白酶有激活作用（136%），其中機(jī)理有待進(jìn)一步探究。β-巰基乙醇對(duì)2株菌株產(chǎn)蛋白酶均有明顯的抑制作用，其通過(guò)將蛋白酶中二硫鍵還原為—SH基團(tuán)而使之失活。金屬蛋白酶抑制劑乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）對(duì)LS4產(chǎn)的蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用，對(duì)LS3產(chǎn)的蛋白酶無(wú)影響，說(shuō)明LS4產(chǎn)的蛋白酶屬于金屬蛋白酶。

3結(jié)論

本試驗(yàn)從大慶油田土壤這一非極端自然環(huán)境中分離獲得2株產(chǎn)低溫堿性蛋白酶的耐冷菌株LS3、LS4，豐富了產(chǎn)低溫堿性蛋白酶耐冷菌的資源庫(kù)。菌株對(duì)pH值（5～9）及鹽濃度（0～4%）均有一定耐受性。LS3菌株為狹義耐冷菌，經(jīng)鑒定為假單胞菌屬，LS4菌株為廣義耐冷菌，經(jīng)鑒定為微小桿菌屬。2株菌株在低溫下能夠良好生長(zhǎng)并產(chǎn)酶，在尿素存在下，LS3產(chǎn)酶活力達(dá)到52.46 U/mL，為投入實(shí)際應(yīng)用提供了有力依據(jù)，是良好的出發(fā)菌種。LS3和LS4菌株所產(chǎn)酶的最適作用溫度分別為40、30 ℃左右，最適作用pH值為8左右，低溫堿性環(huán)境中蛋白酶均維持較高活性，而熱穩(wěn)定性差，在較高溫度（>50 ℃）下快速失活，為蛋白酶的應(yīng)用提供基本條件。金屬離子對(duì)LS3菌株產(chǎn)蛋白酶的活力均有一定程度的抑制作用，Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+濃度的抑制作用較為明顯，表明此蛋白酶的作用不需要金屬離子的參與，EDTA對(duì)其無(wú)影響也可證實(shí)這一點(diǎn)。Cu2+、Zn2+濃度可使LS4菌株產(chǎn)的蛋白酶完全失活，其對(duì)EDTA敏感，說(shuō)明屬于金屬蛋白酶。而吐溫80作為穩(wěn)定劑，對(duì)2個(gè)蛋白酶均有激活效果。該研究對(duì)蛋白酶的實(shí)際應(yīng)用具有指導(dǎo)性意義。

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