玫瑰黃鏈霉菌Men—myco—93—63產(chǎn)抗生素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

韓興+劉亞南+甄丹妹++劉大群+赤國彤

摘要：以玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63為發(fā)酵菌株，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)、中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，以抗生素產(chǎn)量為響應(yīng)值，對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。首先，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出具有正顯著效應(yīng)的花生餅粉和玉米漿。其次，通過最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域。最后，采用中心復(fù)合試驗(yàn)對這2個因素進(jìn)行優(yōu)化。最終確定發(fā)酵的最適培養(yǎng)基含量配方為葡萄糖2%，可溶性淀粉1%，花生餅粉4.96%，玉米漿2.66%，氯化鈉0.4%，碳酸鈣0.3%，磷酸二氫鉀0.02%。優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基抗生素產(chǎn)量為2 030.6 mg/L，比優(yōu)化前的771.9 mg/L 提高了1.63倍。

關(guān)鍵詞：玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63；發(fā)酵；抗生素；響應(yīng)面分析

中圖分類號： S476+.8文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0100-03

玫瑰黃鏈霉菌（Streptomyces roseoflavus） Men-myco-93-63是從馬鈴薯瘡痂病自然衰退土壤中分離到的1株對多種植物病原菌具有抑制作用的拮抗鏈霉菌[1]。通過研究發(fā)現(xiàn)，該菌及其次生代謝產(chǎn)物對不同致病力的棉花黃萎病菌都有很強(qiáng)的抑制作用，可以導(dǎo)致黃萎病菌菌絲變形，并伴隨有溶菌作用[2-3]。溫室及大田試驗(yàn)結(jié)果表明，其發(fā)酵液對棉花黃萎病有較好的田間防效[3]。趙志泉等從玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63發(fā)酵液中分離得到抑制棉花黃萎病菌的抗生素，并對其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，但并未明確其具體結(jié)構(gòu)[4]。張艷對玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，篩選出了較適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基[5]。[JP]

Plackett-Burman法基于不完全平衡塊原理，能從眾多變量中快速篩選出最為重要的因素[6]。響應(yīng)面方法（response surface methodology，RSM） 能將試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模聯(lián)合起來，通過局部試驗(yàn)回歸擬合因素與結(jié)果間的全局函數(shù)關(guān)系[7]，得到準(zhǔn)確有效的試驗(yàn)結(jié)論。本試驗(yàn)在前期試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，以抗生素產(chǎn)量為目標(biāo)響應(yīng)值，通過一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，改良發(fā)酵培養(yǎng)基的組分含量，以期提高發(fā)酵過程中抗生素的產(chǎn)量。[JP]

1材料與方法

[HTK]1.1試驗(yàn)材料[HT]

1.1.1供試菌株

玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院分子植物病理學(xué)和植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基；初始發(fā)酵培養(yǎng)基含量配方：葡萄糖2.4%，可溶性淀粉0.8%，花生餅粉1.5%，玉米漿08%，氯化鈉0.4%，碳酸鈣0.3%，磷酸二氫鉀0.02%。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵培養(yǎng)

將玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 14 d 至孢子發(fā)育成熟，將孢子刮下，制成孢子懸浮液，調(diào)整孢子濃度為5×108 CFU/mL，向裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的 500 mL 三角瓶中接入200 μL孢子懸浮液，在30 ℃、200 r/min 的搖床上振蕩培養(yǎng)5 d。

1.2.2抗生素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取0.010 3 g抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，抗生素提取方法參照趙志泉等的方法[4]。加80%乙醇溶解，容量瓶中定容至 50 mL，得濃度為0.206 mg/mL的抗生素溶液，梯度稀釋8、10、12、14、16、32、64倍至濃度分別為0025 8、0.020 6 、0.017 2、0.014 7 、0.012 9、0.006 4、0.003 2 mg/mL，測定不同濃度溶液在363 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3抗生素含量測定方法

玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63所產(chǎn)生的抗生素不溶于水，即存在于發(fā)酵液的沉淀中。將發(fā)酵液搖勻，取5 mL發(fā)酵液，加入20 mL乙醇，振蕩混勻，此時抗生素即溶于液相（含有80%乙醇）中，12 000 r/min離心 3 min，將上清液稀釋40倍，紫外分光光度計(jì)測其在 363 nm 處的吸光度，即為響應(yīng)值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算濃度。[JP]

1.2.4Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)

利用Design Expert 8.0.6.1 軟件，選取n=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對初始發(fā)酵培養(yǎng)基中7個組分進(jìn)行考察，試驗(yàn)因素和水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。每個試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5最陡爬坡試驗(yàn)

1.2.7最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基驗(yàn)證

根據(jù)中心復(fù)合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，以初始培養(yǎng)基為對照，進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)5次，求其平均值。

2結(jié)果與分析

2.1抗生素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[HT]

以抗生素濃度為橫坐標(biāo)（x），363 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)（y）作圖（圖1），得到線性回歸方程y=50.844x+0.050 6，r=0.999 5，在所測濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

PB試驗(yàn)結(jié)果和方差分析分別如表2、表6所示，模型確

2.3最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表6可知，花生餅粉含量和玉米漿含量都為正效應(yīng)，效應(yīng)系數(shù)分別為0.061和0.071，根據(jù)這2個因素的效應(yīng)大小確定爬坡步長，其他不顯著因素均取低水平，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3所示。由表3可知，D363 nm最大值出現(xiàn)在第2組試驗(yàn)附近，因此將其作為后續(xù)中心復(fù)合試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.4中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

試驗(yàn)共設(shè)13個試驗(yàn)點(diǎn)，其中包括8個析因點(diǎn)和5個中心點(diǎn)，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次二元回歸擬合，得到回歸方程Y=0550-0.079C-0.038D-0.025CD-0.068C2-0.037D2，模型R=0.985 4，表明模型擬合良好，對回歸方程進(jìn)行方差分析，P<0.000 1，模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.078 7不顯著，說明模型有意義，因此可用此模型分析預(yù)測響應(yīng)值。同時，由表7可知，交互項(xiàng)CD的P=0.010 5，達(dá)到顯著水平，說明花生餅粉含量和玉米漿含量存在一定的交互作用，響應(yīng)曲面及等高線圖如圖2所示，響應(yīng)曲面存在極值點(diǎn)。

以363 nm處紫外吸光度最大即抗生素產(chǎn)量最大為目標(biāo)，利用Design expert 8.0.6.1軟件對回歸方程求解極大值，得到最終優(yōu)化結(jié)果為花生餅粉含量4.96%，玉米漿含量266%。在最佳優(yōu)化條件下預(yù)測的最佳響應(yīng)值為0.574 7。

2.5最優(yōu)條件驗(yàn)證

為了驗(yàn)證預(yù)測值，按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表8所示。優(yōu)化后D363 nm為0.566 8與預(yù)測值0.574 7非常接近，可見該模型能很好地預(yù)測發(fā)酵過程中抗生素的產(chǎn)量。將D363 nm代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，并按照稀釋濃度計(jì)算，可得優(yōu)化后抗生素產(chǎn)量為2 030.6 mg/L，比優(yōu)化前的771.9 mg/L提高了

3結(jié)論與討論

玫瑰黃鏈霉菌（Streptomyces roseoflavus）Men-myco-93-63對棉花黃萎病有較強(qiáng)的抑制作用，但利用發(fā)酵液進(jìn)行生物防治在成本、運(yùn)輸、保存等方面存在諸多不便，因此，從發(fā)酵液中提取分離得到抗生素尤為必要，而發(fā)酵培養(yǎng)基對抗生素的代謝合成有著重要影響[9]。因此本試驗(yàn)通過改良發(fā)酵培養(yǎng)基來獲得更高的抗生素產(chǎn)量。

響應(yīng)面法作為一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，近年來已被廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域[10-13]，特別是發(fā)酵行業(yè)，相對于正交試驗(yàn)只能對單個孤立的試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析，響應(yīng)面法在試驗(yàn)條件尋優(yōu)過程中可以連續(xù)地對試驗(yàn)的各個水平進(jìn)行分析，因而可以得到更為準(zhǔn)確的最優(yōu)條件。

本試驗(yàn)利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)從初始發(fā)酵培養(yǎng)基中篩選出花生餅粉含量和玉米漿含量2個影響抗生素產(chǎn)量的主要因素。在此基礎(chǔ)上，通過最陡爬坡試驗(yàn)找到其最優(yōu)值區(qū)域，在花生餅粉含量為6%、玉米漿含量為3%附近。并以此為中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，用響應(yīng)曲面分析法確定花生餅粉含量和玉米漿含量的最佳因素水平分別為4.96%、266%。最后按照響應(yīng)面優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到實(shí)際抗生素產(chǎn)量為2 030.6 mg/L，與模型預(yù)測值非常接近，并且，相對于初始發(fā)酵培養(yǎng)基的 771.9 mg/L，抗生素產(chǎn)量提高了1.63倍。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu D Q. Biological control of Streptomyces scabies and other plant pathogens[D]. Minnesota：University of Minnesota，1992.

[2]Meng Q F，Yang W X，Zhang Q L，et al. Field evaluation of antagonistic Streptomyces Men-myco-93-63 preparation in biocontrol of cotton verticillium wilt[C]//Proceedings of the 15th International Plant Protection Congress. Beijing：Foreign Languages Press，2004：153.

[3]劉大群，楊文香，祁碧菽，等. 拮抗鏈霉菌Men-myco-93-63及其發(fā)酵液對棉花黃萎病菌生長的影響[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22（4）：79-82.

[4]趙志泉，赤國彤，孟慶芳，等. 玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63有效成分的初步提取與純化[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（1）：76-78.

[5]張艷.生防菌株Men-myco-93-63發(fā)酵工藝優(yōu)化研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[6]Sayyad S A，Panda B P，Javeed S，et al. Optimization of nutrient parameters for lovastatin production by Monascus purpureus MTCC 369[LM]

[KG1*2/3]under submerged fermentation using response surface methodology[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2007，73（5）：1054-1058.

[7][JP3]梅樂和，胡升，許靜，等. 納豆枯草桿菌的篩選和納豆激酶發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版），2004，38（10）：1355-1360.[JP]

[8]劉青芝，李霞，蘇移山，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化γ-聚谷氨酸發(fā)酵條件[J]. 中國生化藥物雜志，2011，32（2）：99-102.

[9]盧彩鴿，董紅平，張殿朋，等. 解淀粉芽胞桿菌MH71搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào)，2015，31（3）：369-377.

[10]Jung J P，Moyano J V，Collier J H. Multifactorial optimization of endothelial cell growth using modular synthetic extracellular matrices[J]. Integrative Biology，2011，3（3）：185-196.

[11]Li X Y，Liu Z Q，Chi Z M. Production of phytase by a marine yeast Kodamaea ohmeri BG3 in an oats medium：optimization by response surface methodology[J]. Bioresource Technology，2008，99（14）：6386-6390.

[12]Yuan L L，Li Y Q，Wang Y，et al. Optimization of critical medium components using response surface methodology for phenazine-1-carboxylic acid production by Pseudomonas sp. M-18Q[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering，2008，105（3）：232-237.

[13]Li C，Bai J H，Cai Z L，et al. Optimization of a cultural medium for bacteriocin production by Lactococcus lactis，using response surface methodology[J]. Journal of Biotechnology，2002，93（1）：27-34.

[FQ）]

江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年第45卷第10期

[SQ*5]

[HT6F]李素霞，莫小榮，覃雪梅，等. 氮鎘交互作用下石灰對白菜的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（10）：103-105.