田七炭疽病病原的分離與鑒定

韋榮昌 唐其 白隆華

摘要：炭疽病是田七生長發(fā)育過程中一種嚴(yán)重的病害，為明確引起炭疽病的病因，從引起田七葉片穿孔和褐化的樣本上分離病原，對病原進(jìn)行致病性測定，對顯微形態(tài)和rDNA ITS分子進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，2種田七炭疽病病原分別為人參炭疽菌（Colletotrichum panacicola）和膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

關(guān)鍵詞：田七；炭疽?。蝗藚⑻烤揖?；膠孢炭疽菌；病原鑒定；發(fā)生規(guī)律；病害防治

中圖分類號： S435.675文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0086-03

田七[Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen]別稱三七、山漆、金不換、南方神草等，為五加科（Araliceae）人參屬（Panax）多年生草本植物，主要以根和根莖入藥[1]。田七為我國著名的傳統(tǒng)中藥，是人參屬植物中皂苷類分子多樣性最豐富、含量最高、最有醫(yī)療保健價值以及最具有開發(fā)利用前景的藥材[2]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)等方面具有較好的生理活性[3-7]，廣泛應(yīng)用于藥品、食品、保健品和化妝品中。然而，由于獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境及嚴(yán)重的連作障礙，導(dǎo)致田七病害發(fā)生種類多、發(fā)病重[8]。2014—2015年，筆者在廣西壯族自治區(qū)南寧市各地田七病害的田間調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了造成田七葉片穿孔和褐化的2種病害，導(dǎo)致葉片大量脫落，嚴(yán)重影響藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量。本研究通過病原分離和鑒定，確認(rèn)人參炭疽菌（Colletotrichum panacicola）和膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）侵染田七是造成其葉片穿孔和褐化的主要原因，為進(jìn)一步系統(tǒng)研究該病的發(fā)生規(guī)律及其病害防控提供參考。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源及癥狀描述

標(biāo)本來源于廣西藥用植物園田七種植基地，通過田間自然感病和人工接種發(fā)病葉片進(jìn)行癥狀描述。

1.2病原菌的分離純化及致病性測定

選取染病田七葉片，在病健結(jié)合組織處切取0.5 cm小塊，依次用75%乙醇浸泡30 s，0.1%氯化汞消毒2 min，滅菌水漂洗3～5次，置于PSA培養(yǎng)基上26 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲長出后挑取菌落的邊緣進(jìn)行純化，通過單孢分離純化后的菌落，得到純培養(yǎng)分離物。待分離獲得的菌株經(jīng)單孢純化后，保存于PSA培養(yǎng)基斜面上，置于4 ℃冰箱中貯存，備用。

依據(jù)針刺接種法進(jìn)行病原菌致病性測定，在健康的田七葉片上接種純培養(yǎng)的分離物（菌絲塊），置于26 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)，3次重復(fù)，以未接種的健康田七葉片作對照，定期觀察葉片的發(fā)病情況。對接種發(fā)病的葉片進(jìn)行病原菌再分離，觀察分離得到的病原菌是否與接種菌株相同。

1.3形態(tài)學(xué)鑒定

對PSA平板上的病原菌菌落特征及產(chǎn)孢情況進(jìn)行觀察分析，同時對分生孢子進(jìn)行革蘭氏染色，顯微測定分生孢子盤、分生孢子梗長以及分生孢子的大小。

1.4分子生物學(xué)鑒定

1.4.1DNA提取

采用易潤華等的方法[9]，用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取病原菌基因組DNA。

[CM（26]1.4.2rDNA ITS區(qū)的擴(kuò)增及測序

以ITS1（5′-TCCGTAG[CM）][LM]GTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物，PCR擴(kuò)增菌株的rDNA ITS序列。反應(yīng)體系：10×Ex Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L Primer ITS1 2 μL，10 μmol/L ITS54 2 μL，Genomic DNA 20 ng，5 U/μL Ex Taq 0.5 μL；ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃ 復(fù)性80 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

用瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，回收目標(biāo)DNA片段，送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化測序。通過BioEdit校對測序結(jié)果，進(jìn)行序列拼接，把拼接好的系列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast相似性比對，選取同源性較高的序列，利用MEGA 5.05軟件的Neighbor-Jorning法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1病害癥狀

標(biāo)本1，葉片染病初生圓形或近圓形黃褐色病斑，中間呈灰褐色至灰色，邊緣黃色暈圈明顯，后期病部易破裂穿孔，病斑較小，直徑2～5 mm（圖1）。標(biāo)本2，病菌主要從葉緣侵入，在葉片上形成半圓形或“V”形病斑，有輪紋，中間呈紅褐色至灰褐色，后期具有黑色小點(diǎn)，周圍有黃暈，病斑較大，直徑8～15 mm（圖1）。

2.2致病性測定

接種葉片表現(xiàn)出與自然病葉相同的癥狀，未接種葉片表現(xiàn)正常，從回接發(fā)病田七葉片上可以100%得到原接種病菌。

2.3形態(tài)學(xué)鑒定

在PSA平板上，病原菌tg-1菌落圓形，邊緣整齊，氣生菌絲初為白色，后漸變?yōu)闇\黃褐色，菌絲毛絨狀，不會形成分生孢子盤；分生孢子為單胞、無色，呈長橢圓形或棍棒狀，大小為（6.0～16.0）μm×（2.5～5.5）μm，平均為12.0 μm×4.0 μm（圖1）。

在PSA平板上，病原菌hb-2菌落圓形，邊緣整齊，氣生菌絲初為白色，后漸變?yōu)榛野咨蛏罨疑?，菌絲棉絮狀；分生孢子盤呈黃褐色墊狀突起，圓形，直徑（85.0～210.0） μm，無剛毛；分生孢子梗短，略呈倒棒狀，（8.0～11.0）μm×（3.0～4.0）μm；分生孢子單胞，無色，長橢圓形，兩頭鈍圓或一端稍尖，大小為（9.0～13.0）μm×（3.0～5.0）μm，平均為 11.0 μm×4.0 μm（圖1）。

2.4分子生物學(xué)鑒定

使用真菌ITS區(qū)域的引物ITS1和ITS4，對病原菌tg-1、hb-2進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得大小為568、556 bp的片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物測序所得的序列拼接后與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，tg-1與已報道的多個人參炭疽菌的序列同源性最高，相似性達(dá)99%；從系統(tǒng)發(fā)育樹也可以看出，tg-1與人參炭疽菌的遺傳距離最近（圖2）；hb-2與多個膠孢炭疽菌的序列同源性最高，相似性達(dá)100%。系統(tǒng)發(fā)育樹也表明，hb-2與多個膠孢炭疽菌的遺傳距離最近（圖2）。參照文獻(xiàn)[10-11]，結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，分別將病原菌tg-1、hb-2鑒定為人參炭疽菌和膠孢炭疽菌。

3討論與結(jié)論

近年來，隨著廣西壯族自治區(qū)政府“田七回家”扶貧項目的啟動，眾多農(nóng)民選擇種植田七脫貧致富，然而田七炭疽病的發(fā)生，嚴(yán)重影響田七產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展和農(nóng)民的增收。作為世界上分布最廣的植物病原菌之一，炭疽菌在致病性、寄主特異性和遺傳同質(zhì)性等方面可分為多種亞組，屬多形態(tài)種[12]，且其分生孢子形態(tài)多相似。因此，單從形態(tài)學(xué)鑒定菌種顯得尤為困難，須要借助分子生物學(xué)加以鑒定[13]。就進(jìn)化速度來說，rDNA ITS區(qū)域比編碼區(qū)快，可以提供更多變異來進(jìn)行種間或種內(nèi)的分子系統(tǒng)研究。本研究根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和分子生物[CM（25]學(xué)分析結(jié)果，將引起田七葉片穿孔和褐化的田七炭疽病病[CM）][FL）]

原菌鑒定為人參炭疽菌或膠孢炭疽菌，但有關(guān)該病害的發(fā)生流行規(guī)律、侵染循環(huán)、防治措施以及抗性品種的選育有待進(jìn)一步研究。

rDNA ITS序列測定是當(dāng)前常用的植物病原分子鑒定方法，然而本研究中病原菌tg-1的rDNA ITS序列既與人參炭疽菌的對應(yīng)序列具有99%的同源性，也與希金斯炭疽菌（C. higginsianum）99%同源，單靠分子生物學(xué)的方法難以鑒定，說明rDNA ITS序列在炭疽病菌（或其他病菌）的鑒定中還存在一定的局限性，須要與形態(tài)學(xué)特征等傳統(tǒng)鑒定方法相結(jié)合才能更好地進(jìn)行病原鑒定。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]喬春玲，丁艷芬，楊崇仁. 三七總皂苷藥理研究進(jìn)展[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2012，14（11）：25-30.

[3]He N W，Zhao Y，Guo L，et al. Antioxidant，antiproliferative，and pro-apoptotic activities of a saponin extract derived from the roots of Panax notoginseng （Burk.） F.H. Chen[J]. Journal of Medicinal Food，2012，15（4）：350-359.

[4]Chen J C，Chen L D，Tsauer W，et al. Effects of ginsenoside Rb2 and Rc on inferior human sperm motility in vitro[J]. The American Journal of Chinese Medicine，2001，29（1）：155-160.

[5]Li W，F(xiàn)itzloff J F. [HJ1.9mm]A validated method for quantitative determination of saponins in notoginseng（Panax notoginseng）using high-performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detection[J]. The Journal of Pharmacy and Pharmacology，2001，53（12）：1637-1643.

[6]Ng T B. Pharmacological activity of sanchi ginseng（Panax notoginseng）[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology，2006，58（8）：1007-1019.

[7]王薇. 三七總皂苷對腦出血患者血腫吸收及血漿基質(zhì)金屬蛋白酶-9的影響[J]. 中草藥，2011，42（5）：963-965.

[8]蔣妮，覃柳燕，葉云峰. 三七病害研究進(jìn)展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，42（9）：1070-1074.

[9]易潤華，朱西儒，周而勛. 簡化CTAB法快速微量提取絲狀真菌DNA[J]. 湛江海洋大學(xué)學(xué)報，2003，23（6）：72-73.

[10]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979：468-475.

[11]陸家云. 植物病原真菌學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：449-459.

[12]譚海文，黎起秦，葉靖平，等. 闊葉十大功勞炭疽病初報[J]. 植物病理學(xué)報，2010，40（4）：446-448.

[13]Hyde K D，Cai L，Cannon P F，et al. Colletotrichum-names in current use[J]. Fungal Diversity，2009，39：147-182.

江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年第45卷第10期

[SQ*5]

[HT6F]馬永強(qiáng). 甘肅省蘋果炭疽病病原鑒定及ITS序列分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（10）：89-91.