蘋果樹皮內(nèi)生菌對蘋果樹腐爛病的防治效果

尹寶重 劉博燕 劉盼 張?jiān)鲁??

摘要：從蘋果樹皮中分離出1株對蘋果腐爛病病菌具有較好拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌——B5014。該菌株對腐爛病病菌的抑菌率達(dá)55.59%，顯著高于其他菌株；通過對菌株B5014發(fā)酵濾液進(jìn)行不同濃度稀釋后發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的不斷降低，菌株B5014發(fā)酵濾液對腐爛病病菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制率不斷下降；田間試驗(yàn)表明，在接種時(shí)間較短（10 d）時(shí)，B5014細(xì)菌懸浮液原液處理可以與生產(chǎn)中常規(guī)使用的80%代森錳鋅800倍液防效基本持平，但到接種20 d時(shí)，防效低于常規(guī)化學(xué)防治方法。

關(guān)鍵詞：蘋果樹；腐爛??；內(nèi)生細(xì)菌；防效

中圖分類號： S436.611.1+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0084-02

河北省是我國最重要的蘋果產(chǎn)區(qū)之一，蘋果樹種植已是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。近年來，隨著氣候、環(huán)境、生產(chǎn)方式的變化，蘋果腐爛病在河北省蘋果種植區(qū)發(fā)生日趨嚴(yán)重，已經(jīng)嚴(yán)重影響到當(dāng)?shù)靥O果產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展[1]?，F(xiàn)階段蘋果腐爛病的防治主要以化學(xué)防治為主，不但污染環(huán)境，而且容易引起農(nóng)藥殘留超標(biāo)，影響果實(shí)品質(zhì)。再加上很多地方對腐爛病的防治并沒有統(tǒng)一的規(guī)范，隨意加大藥量和用藥頻率的問題突出，導(dǎo)致病原菌抗藥性增強(qiáng)，形成惡性循環(huán)。因此，篩選經(jīng)濟(jì)高效、環(huán)境友好的拮抗菌，對進(jìn)一步促進(jìn)“低毒高效”的蘋果腐爛病防控模式的構(gòu)建，推進(jìn)河北省草莓產(chǎn)業(yè)良性、健康發(fā)展都具有重要意義。

有關(guān)蘋果腐爛病菌拮抗菌的篩選研究，前人進(jìn)行過一些。比如，高克祥研究表明，內(nèi)生螺旋毛殼菌ND35產(chǎn)生的抗生素能有效抑制蘋果樹腐爛病病菌的生長，且它產(chǎn)生的發(fā)酵液有助于愈傷組織的形成[2]；原犇犇也證明，灰色鏈霉菌的1個(gè)變種對蘋果樹腐爛病病菌菌絲生長有抑制作用[3]；展麗然提出，某些土壤中有一種放線菌，對腐爛病病菌具有拮抗作用[4]。類似的研究還有很多，但這些技術(shù)的篩選過程都比較長，而且拮抗效果往往不夠穩(wěn)定。內(nèi)生真菌作為普遍存在于寄主植物中的真菌，能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，可以起到抵御外來病原菌入侵的作用。本研究擬通過組織分離法和平板對峙試驗(yàn)從蘋果樹皮中分離和篩選內(nèi)生細(xì)菌，研究其對蘋果樹腐爛病病菌的抑菌作用，為蘋果腐爛病生物防治技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化提供新的參考。

1材料與方法

[HTK]1.1供試材料[HT]

（1）供試病原菌：蘋果腐爛病病菌，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

（2）供試植物材料：于2015年12月，從山東省煙臺(tái)市、河北省石家莊市、甘肅省慶陽市等地選擇100株10～15年生，腐爛病發(fā)生嚴(yán)重的植株，在它們健康的主干、主枝、側(cè)枝、小枝、木質(zhì)部等部位的樹皮上采集獲得。蘋果品種為富士。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離與篩選

采用組織分離方法[5]，將采集的樹皮用水洗凈，剪至0.2 cm2左右，用75%乙醇、4%次氯酸鈉充分消毒后，無菌水清洗。將徹底消毒的樹皮研磨成勻漿，無菌水稀釋，均勻涂抹在PDA培養(yǎng)基平面上，長出菌落后采用劃線法純化培養(yǎng)。將純化后獲得的菌株采用對峙培養(yǎng)法對內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行篩選，將打好的直徑為4 mm的蘋果樹腐爛病病菌菌餅放于PDA平板2側(cè)，用接菌環(huán)蘸取待測細(xì)菌懸浮液在平板中央劃線，放于培養(yǎng)箱中27 ℃黑暗培養(yǎng)4 d。統(tǒng)計(jì)抑菌帶寬度，選取抑菌帶最寬的5種細(xì)菌，分別測量病原菌向拮抗菌方向生長的長度和對照中病原菌生長的半徑，以抑制率表示拮抗作用，選取抑制率最高的細(xì)菌進(jìn)行室內(nèi)和田間生物測定。抑制率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑]×100%。

1.2.2B5014菌株對蘋果樹腐爛病病菌的抑菌效果

發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病病菌菌絲生長的抑制效果：挑取B5014接入NB液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)24 h（濃度約為8×109 CFU/mL），5 000 r、20 min離心2次，收集上清液去除雜菌，得無菌濾液。在48 ℃下，將無菌發(fā)酵濾液混入滅菌PDA培養(yǎng)基中，混勻后倒平板。平板中央接種蘋果樹腐爛病病菌菌餅，27 ℃培養(yǎng)48 h后測量菌落直徑。PDA培養(yǎng)基中，無菌濾液的最終稀釋倍數(shù)分別為20、100、200、1 000倍，以加滅菌蒸餾水的處理為對照[6-7]。發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病病菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果：取20 μL病原菌分生孢子懸浮液置于無菌載玻片上，再量取20 μL上述過濾液滴入載玻片上的分生孢子懸浮液滴中[8]。保濕條件下25 ℃靜置，分別于5、13 h后，以PD培養(yǎng)液作為對照，觀察病原菌分生孢子萌發(fā)情況。每個(gè)處理4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.2.3田間防效試驗(yàn)

試驗(yàn)于2012年5月10日在河北省保定市河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果試驗(yàn)基地進(jìn)行，供試樹種為紅富士，樹齡8年，株行距3 m×4 m。土壤pH值為7.2，有機(jī)質(zhì)含量為1.28%，水肥條件良好。選取其中10年生、長勢相近的蘋果樹，在主枝上用6 mm打孔器打孔并接種旺盛生長的鏈格孢屬內(nèi)生真菌菌餅，用保鮮膜包裹保濕，3 d后去掉菌餅，再接種腐爛病菌菌餅，保濕1周后去掉保鮮膜，記作處理A；以80%代森錳鋅800倍液作為對照處理，在接種腐爛病菌菌柄的部位涂抹80%代森錳鋅800倍液，用量為20 mL/m2，記作處理B；以不接內(nèi)生真菌的處理為空白對照（CK），每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8棵樹。記錄蘋果樹腐爛病的發(fā)生情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病斑面積。發(fā)病率=病株數(shù)/總株數(shù)×100%；病斑面積=1/4×π×長徑×短徑。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離與篩選

通過對峙試驗(yàn)的篩選，共獲得125株細(xì)菌，其中抑制率較高的有7種，所選的7種抑菌效果較好菌株的抑菌帶寬度均在12 mm以上（表1）。其中，抑菌帶最寬的是B5014，達(dá) 16.4 mm，顯著高于其他菌株。菌株B5014菌落半徑僅為131 mm，顯著低于其他菌株。從抑制率來看，所選7個(gè)菌株的抑制率均超過了40%，其中菌株B5014最高，達(dá)5559%，且在0.05水平上顯著高于其他菌株。

2.2內(nèi)生細(xì)菌B5014對蘋果樹腐爛病病菌的抑菌效果

由表2可知，B5014發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)具有明顯的抑制效果，且這種抑制效果隨著發(fā)酵濾液濃度的降低而降低。從B5014不同濃度發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病病菌菌絲抑制情況來看，隨著發(fā)酵濾液濃度降低，腐爛病病菌菌落直徑不斷增大，到稀釋500倍時(shí)，其菌落直徑已達(dá)到23.1 mm，與對照差異不顯著；稀釋20倍時(shí)，B5014發(fā)酵濾液對腐爛病病菌菌絲抑制率最高，達(dá) 85.1%，顯著高于其他濃度梯度。從B5014不同濃度發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病孢子萌發(fā)情況來看，稀釋500倍時(shí)，發(fā)酵濾液對病原菌孢子的抑制作用已經(jīng)很弱，孢子萌發(fā)率已經(jīng)達(dá)到618%，與對照無顯著差異。發(fā)酵液稀釋20倍時(shí)，對病原菌孢子的抑制作用非常強(qiáng)，抑制率為100%，顯著高于其他處理。

2.3內(nèi)生細(xì)菌B5014防治蘋果樹腐爛病的田間試驗(yàn)結(jié)果

表3是內(nèi)生細(xì)菌B5014防治蘋果樹腐爛病的田間藥效試驗(yàn)結(jié)果。由表3可知，在2個(gè)時(shí)間段的觀測中，B5014細(xì)菌懸浮液原液處理的病斑面積均顯著低于空白對照，且接種腐爛病菌10 d時(shí)與80%代森錳鋅800倍液處理差異不顯著。從防效來看，在接種腐爛病菌10、20 d時(shí)，B5014細(xì)菌懸浮液原液處理的防效分別可達(dá)79.4%、77.5%。由此可知，在接種時(shí)間較短的時(shí)候，B5014細(xì)菌懸浮液原液處理可以與生產(chǎn)中常規(guī)使用的80%代森錳鋅800倍液防效基本持平，但隨著病菌接種時(shí)間的延長，防效則低于常規(guī)化學(xué)防治方法。[FL）]

3結(jié)論與討論

蘋果樹腐爛病是目前蘋果生產(chǎn)中非常嚴(yán)重的病害之一，針對腐爛病的防治問題也一直屬于蘋果生產(chǎn)中的熱點(diǎn)問題。但由于目前生產(chǎn)中大量采用化學(xué)方法進(jìn)行防治，導(dǎo)致果實(shí)中農(nóng)藥殘留高，環(huán)境也因此受到很大影響。所以，開發(fā)一些環(huán)境友好型的技術(shù)、方法就成為目前蘋果樹腐爛病防治中的重要研究方向。本研究在蘋果樹皮中篩選出對蘋果樹腐爛病具有較好拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌B5014，經(jīng)過對它的發(fā)酵濾液進(jìn)行不同濃度梯度稀釋后發(fā)現(xiàn)，不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵濾液對腐爛病病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用有顯著差異。這為進(jìn)一步研究該菌株的抑菌機(jī)制及作相關(guān)鑒定都提供了一定的參考。同時(shí)，田間試驗(yàn)也表明，應(yīng)用B5014細(xì)菌懸浮液，對蘋果樹腐爛病的防效比生產(chǎn)中常規(guī)使用的80%代森錳鋅800倍液要低一些。推測這可能與未將B5014菌株加工成劑型，影響其功能的有效發(fā)揮有關(guān)。因此，接下來將進(jìn)一步對B5014的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以使其更好地在蘋果樹腐爛病防治中發(fā)揮功效。

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