玉米圓斑病菌侵染體系的建立

楊月 張瀟雅 +孫冬梅 鄧馨

摘要：以玉米自交系B73作為研究對象，以玉米圓斑病菌為供試菌株，采取玉米離體葉片侵染與活體整株侵染相對比的方式，通過觀察侵染早期不同時(shí)間的玉米葉片，測定相關(guān)POD酶活性及相關(guān)基因表達(dá)量變化等，對侵染早期玉米葉片的生理指標(biāo)和分子指標(biāo)進(jìn)行研究，通過比較這2種接菌方式對玉米早期生理生化表型的的影響，來篩選一種較為便捷實(shí)用的試驗(yàn)方法。結(jié)果表明，離體葉片侵染體系與活體植株侵染在侵染初期所選取的各種生理生化指標(biāo)方面變化無差異；離體葉片侵染體系具有操作簡單、重復(fù)性高、節(jié)約時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)，可以作為整株侵染的替代體系，為研究早期調(diào)控提供試驗(yàn)手段。

關(guān)鍵詞：玉米；圓斑病菌；侵染體系；早期調(diào)控

中圖分類號： S435.131文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0081-03

玉米是一種重要的糧食作物，其播種面積和產(chǎn)量僅次于水稻、小麥居世界第3位，平均單產(chǎn)則居第1位[1]。玉米真菌病害是影響其產(chǎn)量的重要因素，其中，玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）和玉米圓斑病菌（Bipolaris zeicola）引起的葉部病害尤為常見[2-3]。1959年姜廣正等首次報(bào)道我國發(fā)生玉米圓斑病[5-7]，該病可侵染玉米葉片、果穗、苞葉、葉鞘和莖稈等部位[8-9]。病原菌對植物的傷害大多與植物體內(nèi)的活性氧代謝失調(diào)有關(guān)[4]，其中描述較多的為苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）與過氧化氫酶（CAT）等[5]。

研究表明，病原菌侵染植物時(shí)病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related protein，PRs）會發(fā)生相應(yīng)的變化，且植物堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）類轉(zhuǎn)錄因子參與了病菌防御以及對各種環(huán)境脅迫的響應(yīng)等[6]。堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）蛋白是真核生物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，bZIP轉(zhuǎn)錄因子在人、動物、植物、微生物和昆蟲中均有發(fā)現(xiàn)[7]。在植物中，bZIP家族中的不同成員參與多種生物學(xué)過程[8-9]，bZIP轉(zhuǎn)錄因子中的B亞族基因是駐膜轉(zhuǎn)錄因子（membrane-tethered transcription factors，MTTFs），參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫（ER）和其他逆境脅迫應(yīng)答[10]。

由于整株侵染操作相對復(fù)雜，且條件控制較困難，重復(fù)性差。相比之下，離體葉片侵染反而可在短期內(nèi)很好地模擬整株侵染的效果，但有關(guān)此方面研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)以玉米圓斑病菌為研究材料，探討了在離體和活體條件下，病害侵染初期植物體POD酶活性、防御過程中轉(zhuǎn)錄因子bZIP中B亞族的相關(guān)基因及病程相關(guān)蛋白的變化，為方便快捷地研究早期調(diào)控以及提供一種較好的試驗(yàn)手段打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

玉米自交系B73由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)鞏志忠教授提供；玉米圓斑病菌由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2培養(yǎng)基

馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA），玉米苗浸汁培養(yǎng)基（玉米苗 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1病原菌純化、擴(kuò)繁

在無菌操作臺中，用接種環(huán)挑取病原菌菌種菌絲于玉米苗浸汁培養(yǎng)基上活化，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，待菌絲長至滿皿。長好的病原菌用打孔器在培養(yǎng)基上豎直打成直徑0.5 cm的菌碟，有菌一面朝下接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)。待菌絲布滿整個培養(yǎng)基即可從培養(yǎng)箱取出，室溫放置黑暗處，促進(jìn)孢子萌發(fā)。

1.3.2玉米的種植

萌發(fā)：營養(yǎng)花卉土（滅菌）按1 ∶[KG-*3]1配蛭石混勻后稱100 g置于直徑10 cm小花盆中，小花盆放置于水盆中浸透水，玉米種子直接播種于浸透水的花盆中，深度約為1～1.5 cm，置于人工氣候箱（28 ℃、16 h光照8 h黑暗）中培養(yǎng)，約3 d后即可萌發(fā)。

移苗：待幼苗生長至3葉1心期時(shí)移入直徑40 cm的大花盆中，按“大田土 ∶[KG-*3]草炭=1 ∶[KG-*3]1”混勻，同時(shí)施加底肥（氮磷鉀復(fù)合肥），用鑷子小心將小苗整株挖出后輕輕抖落根部泥土，若殘留太多可在水盆中輕輕涮洗后再移入土中（盡量不要傷根），隨后澆足量的水。移苗后于溫室中培養(yǎng)，保持室內(nèi)溫度為30 ℃，相對濕度60%，定期觀察調(diào)節(jié)溫度、濕度計(jì)和通風(fēng)機(jī)及水簾，每周澆水1次，同時(shí)追肥，按照5 g復(fù)合肥溶于10 L自來水中的比例，每盆澆水3 L。

1.3.3玉米葉片侵染處理

離體：取生長發(fā)育及孢子萌發(fā)均勻的病原菌平皿，用打孔器打下同樣大小的菌碟備用。玉米生長到約7葉1心期時(shí)剪下第3張和第4張葉子，取發(fā)育狀態(tài)相近的3～5 cm 1段放入鋪有濕潤濾紙的直徑90 mm玻璃培養(yǎng)皿中，正面朝上，將打好的菌碟有菌一面朝下緊貼葉片放好，每段葉片上均勻放置3個菌碟，每皿2張葉片，蓋好皿蓋，放于28 ℃培養(yǎng)箱保溫，分別于接菌后2、12、24 h取樣，以未接菌的葉片作為空白對照，每個處理3次重復(fù)。

活體：病原菌同樣用打孔器打好菌碟備用。取相同生長階段的玉米，連同小花盆一起放入大號透明塑料箱中，底部加濕潤濾紙，用支架固定葉片，將病原菌菌碟接種于葉片上，蓋好蓋子，保持溫度、濕度，取樣方式同離體葉片。

1.3.4葉片透明與顯微觀察

取大約0.5 cm2大小的葉片于“無水乙醇 ∶[KG-*3]冰醋酸=1 ∶[KG-*3]1”的固定液（現(xiàn)用現(xiàn)配）中固定24 h，蒸餾水沖洗后放入飽和水合氯醛溶液中1 h即完成透明。取出葉片用蒸餾水沖洗干凈殘留液體，放在載玻片上，加1滴苯胺藍(lán)染色10 min，用蒸餾水沖洗掉染液滴加1滴50%甘油，蓋上蓋玻片，進(jìn)行顯微觀察。

1.3.5過氧化物酶（POD）酶活測定

愈創(chuàng)木酚法[11-12]進(jìn)行POD的測定：在pH值7.8的PBS中加入3 mL POD反應(yīng)液于比色皿中，以此作為調(diào)零組300 μL，試驗(yàn)組粗酶液稀釋10倍取300 μL加入3 mL反應(yīng)液，在470 nm下每隔1 min讀數(shù)1次，共讀5次。以1 min D值變化（升高）0.01為1個酶活性單位（U）來計(jì)算結(jié)果。

[JZ]POD[U/（g·min）]=（ΔD470 nm×Vt）/（m×Vs×0.01×t）。

式中：ΔD470 nm為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；m為樣品鮮質(zhì)量，g；t為反應(yīng)時(shí)間，min；Vt為提取酶液總體積，mL；Vs為測定時(shí)取用酶液體積，mL。

1.3.6光合熒光參數(shù)測定和數(shù)據(jù)分析

將接菌后不同時(shí)間取樣的玉米葉片暗處理30 min，使用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)測定熒光參數(shù)Fv/Fm，數(shù)據(jù)用Imaging Win v2.41a讀出，導(dǎo)入Excel中進(jìn)行分析。Fv/Fm表示PSⅡ的最大光合潛能，計(jì)算公式為Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm。

1.3.7關(guān)鍵基因表達(dá)量分析

利用TaKaRa公司的RNAiso Plus（Total RNA提取試劑盒）進(jìn)行提取玉米葉片RNA。經(jīng) M-MLV反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后利用Toyobo公司的SYBRGreen Realtime PCR Master Mix進(jìn)行Real-time PCR。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。以18S作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析基因相對表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

[HTK]2.1玉米圓斑病菌離體侵染與整株活體侵染及顯微觀察[HT]

由圖1可見，離體葉片和活體葉片接菌后，玉米圓斑病菌均在接菌處理2 h開始萌發(fā)，12 h菌絲伸長侵入組織，24 h菌絲大量繁殖。表明離體葉片接菌和整株活體接菌對玉米圓斑病菌的侵染過程并未產(chǎn)生影響，試驗(yàn)中可以替代活體植株。[FL）]

由圖2可見，玉米圓斑病菌侵染后，離體葉片和活體整株葉片的POD酶活性呈現(xiàn)出先下降后升高再下降的相同趨勢，但變化均并不明顯，整體來看趨于穩(wěn)定。

2.3光合熒光參數(shù)測定

光合熒光參數(shù)Fv/Fm表示光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的最大光合潛能，是反映植物生長狀態(tài)的一項(xiàng)重要生理指標(biāo)。由圖3可見，接種玉米圓斑病菌后葉片的光合熒光參數(shù)Fv/Fm變化不大，一直處于正常范圍內(nèi)，說明在侵染前期，植株并未受到明顯影響。從圖3中還可看出，離體葉片和活體葉片的光合熒光參數(shù)Fv/Fm都是處于正常范圍內(nèi)小幅波動。

2.4圓斑病菌侵染后關(guān)鍵基因表達(dá)量分析

玉米圓斑病菌后[WTBX][STBX]pr3、pr5[WTBZ][STBZ]基因的Real-time PCR結(jié)果。由圖4可見，離體葉片接菌24 h引起[WTBX][STBX]pr3和pr5[WTBZ][STBZ]基因表達(dá)急劇上調(diào)，活體侵染12～24 h同樣引起了上述2個基因的顯著上調(diào)。說明無論是離體葉片還是活體葉片，病菌的侵入均調(diào)控了相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)，植物體啟動了抵抗病菌侵入的程序來對抗病菌的入侵，即pr基因表達(dá)上調(diào)。

bZIP轉(zhuǎn)錄因子是植物中普遍存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與各種脅迫的早期調(diào)控，其中B亞族為駐膜轉(zhuǎn)錄因子，在正常條件下存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，當(dāng)受到侵害時(shí)會調(diào)控相關(guān)應(yīng)答基因的表達(dá)，來抵抗外界脅迫。bzip28、bzip17和bzip60都是駐膜轉(zhuǎn)錄因子，由圖5可見，在玉米圓斑病菌侵染玉米后，無論是離體葉片還是活體葉片中的[WTBX][STBX]bzip28[WTBZ][STBZ]表達(dá)量均明顯上調(diào)，二者表現(xiàn)一致。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過2種病原菌對玉米進(jìn)行短期侵染試驗(yàn)，分別采[CM（25]用離體葉片侵染和整株活體侵染2種方法的比較，期間對

2種侵染方法的葉片進(jìn)行顯微觀察、POD酶活性測定、NBT活性氧染色、光合熒光參數(shù)測定以及關(guān)鍵基因的表達(dá)量分析來對比2種侵染體系在侵染前期對植物的影響。結(jié)果表明，離體葉片侵染和整株活體侵染在侵染前期并無明顯差別，而離體葉片侵染較活體整株侵染操作簡單且重復(fù)性好。結(jié)果表明，在研究侵染前期病原菌誘導(dǎo)病害相關(guān)基因調(diào)控下游靶基因的信號途徑時(shí)，可以采用較為方便快捷且節(jié)省試驗(yàn)材料的方法來進(jìn)行取樣，離體葉片侵染可以滿足試驗(yàn)要求。

bZIP類轉(zhuǎn)錄因子在總數(shù)上占較大比重，且不同的物種所含有bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員不同。對于植物在逆境下的基因表達(dá)調(diào)控具有重要作用。轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，可以直接或間接地識別或結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上，從而參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)，廣泛參與植物低溫、干旱、高鹽、抗病等逆境應(yīng)答以及植物生長發(fā)育的調(diào)控。以往的bZIP轉(zhuǎn)錄因子很多研究主要集中在非生物脅迫如干旱、高鹽、激素等作用中的調(diào)節(jié)機(jī)制，但對生物脅迫下bZIP轉(zhuǎn)錄因子的功能研究報(bào)道較少，尤其在對病原菌侵染的應(yīng)答方面研究還不是很完善。通過圓斑病菌侵染離體與活體植株的研究證實(shí)，bZIP轉(zhuǎn)錄因子在信號傳導(dǎo)途徑前期發(fā)揮作用，在侵染24 h時(shí)葉片仍然維持正常的生理狀態(tài)。在保溫保濕的條件下，72 h后葉片出現(xiàn)葉邊緣發(fā)黃萎蔫的情況，白亞君等指出，在接菌的時(shí)候?yàn)榱吮苊饩撀湫枰媚酒蚓€繩固定[16]，這就給試驗(yàn)造成了一定的困難，本試驗(yàn)采用的離體接菌方式在培養(yǎng)皿中接菌，不存在菌碟脫落的困擾，結(jié)合以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)可初步判定，在病菌侵染早期，即72 h以內(nèi)可以采用離體葉片接菌的方式作為一種方便快捷的試驗(yàn)方法。

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