曼氏迭宮絳蟲中亮氨酸氨基肽酶基因的生物信息學(xué)分析和轉(zhuǎn)錄水平檢測

李奕基 符瑞佳 周曉君 尹飛飛 梁鵬 呂剛 梁培

曼氏迭宮絳蟲中亮氨酸氨基肽酶基因的生物信息學(xué)分析和轉(zhuǎn)錄水平檢測

李奕基1符瑞佳1周曉君2尹飛飛1梁鵬1呂剛1梁培1

目的 檢測曼氏迭宮絳蟲的3個亮氨酸氨基肽酶亞類（leucine aminopeptidases of Spirometra mansoni，SmLAPs）基因在蟲體不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平，為進一步病原診斷研究奠定基礎(chǔ)。方法運用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對3個亮氨酸氨基肽酶亞類編碼蛋白的氨基酸序列的功能區(qū)域、免疫學(xué)特征、信號肽和跨膜區(qū)預(yù)測分析。應(yīng)用Real time PCR方法檢測SmLAPs在曼氏迭宮絳蟲的成節(jié)、孕節(jié)和裂頭蚴階段的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果對SmLAPs編碼氨基酸序列的保守區(qū)域進行比對，SmLAPa與SmLAPb、SmLAPc的氨基酸序列一致性均為38%，SmLAPb和SmLAPc的一致性也只有44%。多功能位點分析發(fā)現(xiàn)，SmLAPs均含有底物結(jié)合位點、鋅離子結(jié)合位點和多肽結(jié)合位點。在B細胞線性表位預(yù)測結(jié)果顯示，SmLAPa有13個、SmLAPb有14個、SmLAPc有13個。T細胞表位預(yù)測中，SmLAPa有12個、SmLAPb有13個、SmLAPc有14個。3個SmLAPs亞類序列中均含有一個強烈的信號肽，并且均沒有跨膜區(qū)域。在蟲體各個發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平檢測中，在成節(jié)階段，SmLAPb的轉(zhuǎn)錄水平是SmLAPa的1.34倍，SmLAPc的轉(zhuǎn)錄水平是SmLAPa的46.53倍。在孕節(jié)階段，SmLAPb的轉(zhuǎn)錄水平是SmLAPa的1.96倍，SmLAPc的轉(zhuǎn)錄水平是SmLAPa的56.89倍。在裂頭蚴階段，只有SmLAPc有轉(zhuǎn)錄，沒有檢測到SmLAPa和SmLAPb的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論在3個SmLAPs亞類基因中，SmLAPc是裂頭蚴病更有價值的免疫診斷分子。

曼氏迭宮絳蟲；亮氨酸氨基肽酶亞類；生物信息特征；轉(zhuǎn)錄水平；免疫診斷分子

曼氏迭宮絳蟲屬于影響人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的寄生蟲［1］，也是一種重要的食源性人畜共患病寄生蟲。曼氏迭宮絳蟲（Spirometra mansoni，Sm）成蟲主要寄生在貓科動物，偶然寄生于人體腸道，但中期裂頭蚴也可寄生于人體，寄生部位多，引起曼氏裂頭蚴病更為嚴重，危害遠大于成蟲。感染裂頭蚴最主要的途徑是食用含有裂頭蚴的生的或是半生的青蛙肉或蛇肉和飲用含有原尾蚴的劍水蚤的水。裂頭蚴病流行區(qū)域非常廣泛，在亞洲、非洲、美洲及歐洲都有發(fā)現(xiàn)［2］。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球有1 400多例病例報道，我國占了上千例［3］。雖然全球病例不多，但是發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，并且裂頭蚴寄生部位多數(shù)在腦部和眼部［4］。裂頭蚴寄生于腦部能夠?qū)е鲁榇せ杳陨踔了劳?；眼裂頭蚴則能夠影響視力甚至導(dǎo)致失明。此外，裂頭蚴還可以寄生于內(nèi)臟組織和皮下組織，且能夠在體內(nèi)移行。目前臨床上針對裂頭蚴病的診斷方法是手術(shù)取活組織進行確診，但是手術(shù)不僅風(fēng)險大，而且適用范圍有限，不適用于內(nèi)臟和深部腦組織的裂頭蚴的診斷。目前，臨床中使用最為廣泛的方法是免疫診斷，不僅便于操作，且價格實惠。免疫診斷的特異性和靈敏度主要是依靠特異性的診斷分子。

亮氨酸氨基肽酶（leucine aminopeptidase，LAP）是一類具有HEXXH（X）（18）E 鋅離子結(jié)合的活性中心的M17金屬蛋白酶，其能夠定位在細胞胞液、微粒體內(nèi)和細胞膜上［5］。LAP是一種細胞表面的亮氨酸氨基肽酶，能夠催化蛋白或是肽類底物的末端亮氨酸殘基的水解。瘧原蟲的LAP可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氨基酸代謝，從而對寄生蟲的生長和發(fā)育發(fā)揮重要作用，是一個抗瘧疾藥物的潛在靶標分子［6］。在曼氏迭宮絳蟲的研究中，對一個亮氨酸氨基肽酶亞類（leucine aminopeptidase C of Spirometra mansoni，SmLAPc）進行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析、原核表達和蛋白純化，證實了其可能是一個潛在的免疫診斷分子［7］。本研究對來源于曼氏迭宮絳蟲的3個LAP［SmLAPa（leucine aminopeptidase A of Spirometra mansoni）、SmLAPb（leucine aminopeptidase B of Spirometra mansoni）、SmLAPc］進行生物信息學(xué)比對分析，并檢測在蟲體各個發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平，為進一開展曼氏裂頭蚴病免疫診斷研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

亮氨酸氨基肽酶核苷酸序列從呂剛等［8］構(gòu)建的曼氏迭宮絳蟲成蟲基因組文庫中獲取。動物組織總RNA提取試劑盒（DP431）、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（KR103）購自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Premix Ex TaqTM II kit購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR八連管購自Axygen公司；電動組織破碎儀（型號：9001272，QIAGEN Hilden公司，德國）；Real time PCR儀器（型號：stratagene Mx3005P instrument，Agilent Technologies公司，美國）；NanoDrop 2000c（Thermo Scientific，美國）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

將從基因組文庫調(diào)取的3個SmLAPs亞類序列利用在線軟件https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行BLASTx比對分析、保守功能域預(yù)測（CDSearch）和多序列比對（multiple alignment）。利用蛋白專家分析工具http：//www.expasy.org/中相關(guān)在線軟件進行信號肽分析、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/進行 B 細胞線性表位和T細胞表位預(yù)測分析。

1.2.2 曼氏迭宮絳蟲成節(jié)、孕節(jié)和裂頭蚴總RNA的提取

①將槍頭、EP管、電動組織破碎儀的轉(zhuǎn)頭等浸泡于0.1%DEPC處理的去離子水中，浸泡過夜，121℃，30 min高壓滅活，烘干備用。

②已加入樣品保護劑的組織，分別置于冰上利用組織破碎儀裂解15～30 min左右，超聲破碎1 min停2 min，次數(shù)視樣品而定，超聲結(jié)束后室溫放置5 min，使其充分裂解。

③按照動物組織總蛋白RNA提取試劑盒說明進行操作。

④將得到的總RNA利用NanoDrop 2000c進行濃度測定和瓊脂糖電泳驗證質(zhì)量。

1.2.3 曼氏迭宮絳蟲各個發(fā)育階段cDNA的合成

①將上述提取的絳蟲的成節(jié)、孕節(jié)和裂頭蚴的總RNA中的基因組DNA去除，按照（5×gDNA Buffer 2 μL；Total RNA 0.5 μg；RNAase-Free ddH2O 補足到10 μL）配制混合液A，徹底混勻。瞬時離心，并置于42℃孵育3 min，然后置于冰上。

②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制混合液按照（10×Fast RT Buffer 2 μL；RT Enzyme Mix 1 μL；FQ-RT Primer Mix 2 μL；RNase-Free ddH2O 補足到 10 μL）進行配制，將配制好的Mix加到gDNA去除步驟的反應(yīng)液A中，充分混勻。

③42℃孵育15 min；95℃孵育3 min處理之后放于冰上，得到的cDNA可用于后續(xù)實驗，-80℃保存。

1.2.4 定量PCR引物

SmLAPs定量PCR檢測引物如表1所示，引物是通過DNA club、Primer Premier相關(guān)軟件針對3個亞類序列中的差異區(qū)域進行設(shè)計。

1.2.5 Real-time PCR檢測

將得到的成節(jié)、孕節(jié)和裂頭蚴階段的cDNA作為模板，以相應(yīng)基因的引物進行擴增。同時以不加cDNA模板作為空白對照。反應(yīng)體系如下：SYBR Premix Ex Taq（2×）10.0 μL；Forward primer 0.2 μL（10 pmol/L）；Reverse primer 0.2 μL（10 pmol/L）；cDNA 2.0 μL；ddH2O 7.6 μL；

將反應(yīng)混合物在Agilent Technologies stratagene Mx3005P儀器上自動運行。每個反應(yīng)均設(shè)3個復(fù)孔，并重復(fù)3次取平均值。記錄各個階段的Ct值，用 2-ΔΔCt法計算 SmLAPa、SmLAPb、SmLAPc在成節(jié)、孕節(jié)和裂頭蚴發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平的差異［9］。

2 結(jié)果

2.1 SmLAPs亞類的序列比對和免疫特征分析

通過對SmLAPs編碼的氨基酸序列保守區(qū)域進行比對，SmLAPa與SmLAPb、SmLAPc的氨基酸序列一致性均為38%，SmLAPb與SmLAPc的一致性也只有44%。此外，進行多功能位點分析發(fā)現(xiàn)，3種SmLAPb亞類均含有底物結(jié)合位點、鋅離子結(jié)合位點和多肽結(jié)合位點。在B細胞線性表位預(yù)測中，Sm-LAPa和SmLAPc有13個B細胞線性表位，而SmLAPb有14個B細胞線性表位。SmLAPa與SmLAPb有8個B細胞線性表位重合，與SmLAPc有9個B細胞線性表位重合；SmLAPb與SmLAPc有13個B細胞線性表位重合。T細胞表位預(yù)測中，SmLAPa有12個T細胞表位，SmLAPb有13個T細胞表位，SmLAPc有14個T細胞表位，然而3個SmLAPs的功能區(qū)域中只有2個完全重疊的T細胞表位，這2個表位也正好是SmLAPa和SmLAPc的2個重合表位區(qū)域，而SmLAPa和SmLAPb只有4個表位重合。

表1 SmLAPs的定量檢測引物序列Table 1 Primer sequences of SmLAPs for real time PCR

2.2 SmLAPs亞類進行信號肽預(yù)測和跨膜結(jié)構(gòu)分析

3個SmLAPs亞類均具有一個強烈的信號肽，SmLAPa位于第18 amino acid（aa）、SmLAPb位于第17aa的位置、SmLAPc位于第21 aa的位置（圖2）。這提示了這3個基因在真核系統(tǒng)中表達均是需要后期蛋白的修飾之后才能發(fā)揮作用的。如后續(xù)開展研究需要進行原核表達，則需要人為去除信號肽方可進行基因的克隆。通過圖3結(jié)果可以得知，這3個亞類均沒有跨膜區(qū)域。

2.3 不同在蟲體發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平檢測

轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果顯示（圖4），在孕節(jié)階段，SmLAPb的轉(zhuǎn)錄水平是SmLAPa轉(zhuǎn)錄水平的1.96倍，SmLAPc轉(zhuǎn)錄水平是SmLAPa轉(zhuǎn)錄水平的56.89倍。成節(jié)階段的SmLAPb的轉(zhuǎn)錄水平是SmLAPa轉(zhuǎn)錄水平的1.34倍，SmLAPc的轉(zhuǎn)錄水平是SmLAPa轉(zhuǎn)錄水平的46.53倍。在孕節(jié)和成節(jié)中，SmLAPc均有轉(zhuǎn)錄，并且轉(zhuǎn)錄水平均高于SmLAPa和SmLAPb的轉(zhuǎn)錄水平。在裂頭蚴階段，只有SmLAPc有轉(zhuǎn)錄，卻沒有檢測到SmLAPa和SmLAPb的轉(zhuǎn)錄。

圖1 曼氏迭宮絳蟲SmLAP亞類氨基酸序列比對Figure 1 Aligment of SmLAPs amino acid sequences

圖2 信號肽預(yù)測Figure 2 Signal peptide pepdiction of SmLAPs sequences

3 討論

LAP是一類金屬肽酶，在調(diào)節(jié)細胞分解代謝和合成代謝平衡中發(fā)揮非常重要的作用［10］。我們從曼氏迭宮絳蟲成蟲文庫中成功獲取了3個SmLAPs的亞類，通過多序列比對，顯示3個基因編碼的氨基酸序列一致性比較低，僅有38%和44%。但是根據(jù)編碼蛋白的氨基酸序列中保守位點分析，可以得知功能位點高度保守，尤其是底物結(jié)合位點和鋅離子結(jié)合位點，只有在多肽結(jié)合位點存在少數(shù)氨基酸差異。雖然在B細胞表位分析中，3個基因的氨基酸序列中的B細胞表位數(shù)量相差較小，并且基本都重合，但是T細胞表位分布存在著較大的差異。楊祖婷等［7］研究發(fā)現(xiàn)，SmLAPc與人類的同源性基因相比較，B細胞表位的氨基酸存在較大的差異。此外，通過信號肽預(yù)測分析，得知3個基因均有強烈的信號肽。在真核生物中，信號肽具有蛋白質(zhì)定向轉(zhuǎn)運功能，能使蛋白分泌到胞外，提高其分泌率。這一預(yù)測結(jié)果提示這3個蛋白均具有胞外分泌的可能。分泌蛋白作為免疫診斷抗原，其特異性和敏感性均優(yōu)于粗抗原［11］。通過酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測研究，發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲的亮氨酸氨基肽酶具有較好的敏感性和特異性，在血吸蟲診斷中具有潛在的免疫診斷價值［12］。綜上所述，SmLAPs在診斷方面有一定的研究價值。此外，根據(jù)Real time PCR定量檢測結(jié)果，3個基因在成節(jié)和孕節(jié)階段均有表達，且SmLAPc亞類的轉(zhuǎn)錄水平最高。在裂頭蚴階段，沒有檢測SmLAPa和SmLAPb亞類的轉(zhuǎn)錄，只檢測到SmLAPc的轉(zhuǎn)錄表達。通過這個結(jié)果更充分的說明，SmLAPc更有可能開發(fā)成檢測靶標分子。

圖3 跨膜螺旋預(yù)測Figure 3 Transmembrane helical prediction of SmLAPs sequences

圖4 SmLAPs轉(zhuǎn)錄水平檢測Figure 4 Transcriptional level detection of SmLAPs

此外，許多研究發(fā)現(xiàn)病原生物主要是依賴肽酶完成許多生理過程［13］。在華支睪吸蟲的研究中，發(fā)現(xiàn)亮氨酸氨基肽酶主要在蟲體的腸道表皮細胞表達，揭示其可能參與了寄生蟲的營養(yǎng)吸收和蛋白質(zhì)代謝過程［14］。在錐蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，亮氨酸氨基肽酶是一個330 kDa的同源四聚體的金屬氨基肽酶，在蟲體營養(yǎng)供應(yīng)中發(fā)揮重要作用［15］。那么，SmLAPs在曼氏迭宮絳蟲不同發(fā)育階段的表達存在差異，這可能是由于SmLAPs在不同的發(fā)育時期，發(fā)揮的作用不同，這進一步提示了SmLAPc可能還是一個有效防控裂頭蚴病的藥物靶點。

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Bioinformatics analysis，transcriptional level detection of leucine aminopeptidases from Spirometra mansoni

LI Yiji1，F(xiàn)U Ruijia1，ZHOU Xiaojun2，YIN Feifei1，LIANG Peng1，LV Gang1，LIANG Pei1
（1.School of Tropical Medicine and Laboratory Medicine,Hainan Medical University，Haikou，Hainan，China，571199；2.Clinical Laboratory，Hainan Province People’s Hospital,Haikou，Hainan，China，570311）

Objective Todetecttranscriptionlevelsof3leucineaminopeptidasesfrom Spirometra mansoni in different developmental stages of the parasite,which lays a foundation for pathogenic diagnosis of further study. Methods Using bioinformatics software,the functional region,immunological characteristics,signal peptide and transmembrane domain of SmLAPs were analyzed.The transcriptional levels of SmLAPs at mature proglottid,gravid proglottid and sparganum stages were detected. Results In the alignment of conserved domains of SmLAPs,the amino acid sequence identities of SmLAPa were 38%compared with SmLAPb and SmLAPc.The identity between SmLAPb and SmLAPc was 44%.Multi-functional sites analysis found that SmLAPs contained substrate binding sites,zinc ion binding sites and peptide binding sites.In the prediction of B cell epitopes,SmLAPa and SmLAPc had 13 B cell epitopes,while SmLAPb had 14B cell epitopes.The T cell epitope prediction showed that SmLAPa,SmLAPb and SmLAPc contained 12,13 and 14 T cell epitopes,respectively.3 SmLAPs had strong signal peptides.In addition,there were no transmembrane regions in the amino acid sequences.The transcriptional level of SmLAPb was 1.34 times and that of SmLAPc was about 46.53 times compared with that of SmLAPb at the mature proglottid.In the gravid proglottid stages,the results of SmLAPb and SmLAPc were 1.96 times and 46.53 times respectively,while SmLAPa was at the background value.Interestingly,at the sparganum stage,SmLAPc transcription expression was detected,whereas the transcriptional levels of SmLAPa and SmLAPb were low. Conclusions SmLAPc might be a valuable diagnostic molecule for Spirometra mansoni infection.

Spirometra mansoni;SmLAPs;Bioinformatics characteristics;Transcriptional level;Diagnostic molecule

國家自然科學(xué)基金課題（81560332）；海南省自然科學(xué)基金課題（814298）

1.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)院，海南，海口571199

2.海南省人民醫(yī)院檢驗科，海南，?？?70311

梁培，E-mail：liangpeilp2012@163.com