體外產(chǎn)氣法研究不同NFC/NDF底物條件下外源纖維素酶的適宜添加水平

陳光吉，宋善丹，彭忠利*，王普昶，吳佳海，王小利，郭春華，王子苑，高彥華，李小冬，柏雪，付錫三

(1.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041；2.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006；3.樂至縣科技局，四川 樂至 641500)

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體外產(chǎn)氣法研究不同NFC/NDF底物條件下外源纖維素酶的適宜添加水平

陳光吉1,2，宋善丹1，彭忠利1*，王普昶2，吳佳海2，王小利2，郭春華1，王子苑2，高彥華1，李小冬2，柏雪1，付錫三3

(1.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041；2.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006；3.樂至縣科技局，四川 樂至 641500)

本試驗旨在利用體外產(chǎn)氣法研究不同非纖維性碳水化合物/中性洗滌纖維(non-fiber carbohydrates/neutral detergent fiber, NFC/NDF)的底物條件下外源纖維素酶(exogenous fibrolytic enzymes, EFE)對底物產(chǎn)氣、降解和發(fā)酵特性的影響，找出不同底物條件下適宜的EFE添加水平。采用2×5交叉分組試驗設計，5個NFC/NDF底物水平 (0.85、1.02、1.19、1.36和1.53)分別添加5種水平的EFE(0, 2, 4, 8 和16 mg/g DM)進行體外發(fā)酵。結(jié)果表明，1)不同NFC/NDF底物和EFE水平對體外總產(chǎn)氣量(GP48)和產(chǎn)氣參數(shù)(b、c和L)均有顯著的影響(P<0.05)，且兩因素互作顯著(P<0.05)；底物1中， GP48、b和c值隨EFE劑量的增加顯著地線性和二次提高(P<0.05)，其中以16 mg/g 水平組較高，L值則呈相反趨勢；底物2～4中，GP48、b和c值隨EFE劑量增加顯著地二次提高(P<0.05)，其中以4 mg/g 水平組較高。2)不同底物對干物質(zhì)消失率(DMD)、酸性洗滌纖維降解率(ADFD)、中性洗滌纖維降解率(NDFD)和氮降解率(ND)均有顯著的影響(P<0.05)，除ND外，EFE水平的添加效應呈現(xiàn)相似結(jié)果；底物1條件下，隨著EFE添加劑量的提高，DMD、ADFD和NDFD顯著地線性提高(P<0.05)，其中均以16 mg/g組最高(P<0.05)；而底物2～4中則以4 mg/g組最高(P<0.05)。3)不同NFC/NDF底物和EFE水平對瘤胃發(fā)酵參數(shù)均有顯著影響(P<0.05)，除丙酸外，兩種因素對其他指標的互作效應均顯著(P<0.05)；在底物1～4條件下，隨著EFE添加劑量的提高，除丙酸以外的其他發(fā)酵參數(shù)顯著地線性和二次提高或降低(P<0.05)；底物1中，對照組pH值、氨態(tài)氮含量和丁酸摩爾濃度顯著高于4、8和16 mg/g組(P<0.05)，相反，16 mg/g組的總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸摩爾濃度和乙酸∶丙酸值較高；底物2～4條件下，pH值和氨態(tài)氮含量以4 mg/g組較低，而TVFA、乙酸摩爾濃度和乙酸∶丙酸值則呈相反的趨勢。4)NFC/NDF=1.53時，添加EFE對體外產(chǎn)氣參數(shù)、降解特性和發(fā)酵特性均無顯著影響(P>0.05)。由此，本試驗發(fā)現(xiàn)，NFC/NDF底物影響了EFE的添加效應，NFC/NDF=0.85時，16 mg/g EFE水平組有較好纖維降解效果；NFC/NDF分別為1.02、1.19和1.36時，EFE最適添加劑量為4 mg/g；NFC/NDF=1.53時，底物中添加EFE沒有正面效應。

體外產(chǎn)氣法；NFC/NDF；外源纖維素酶；適宜添加水平

反芻動物日糧中，纖維素和半纖維素是最重要的結(jié)構(gòu)性碳水化合物，瘤胃微生物可以產(chǎn)生催化水解這些碳水化合物的酶，但是這兩種碳水化合物復雜而致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)制約了反芻動物對它們的消化和利用。為了克服這種因素，很多學者做出了巨大努力，其中外源纖維素(exogenous fibrolytic enzymes, EFE)在反芻動物日糧中的作用研究較多[1-2]，然而據(jù)文獻報道其結(jié)果不盡相同[3-4]。這是由于EFE的作用效果受諸多因素的影響，包括酶的類型和添加量、動物飼糧的類型和動物的生產(chǎn)水平等[5-6]。因此，研究EFE在反芻動物日糧中的適宜添加條件，對深入了解日糧因素與酶添加形式的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，以及合理利用EFE來提高日糧結(jié)構(gòu)性碳水化合物利用率具有重要的作用。就日糧因素而言，酶的作用效果因粗料的類型[7-8]、酶的應用方法[9-10]以及日糧的結(jié)構(gòu)[5]不同而異。在日糧結(jié)構(gòu)因素中，長期以來，人們僅以日糧精粗比這一指標來衡量反芻動物的日糧營養(yǎng)水平，但因它不能精準有效反映反芻動物日糧的碳水化合物組成而顯得過于籠統(tǒng)[11]。與日糧精粗比這個概念相比，非纖維性碳水化合物/中性洗滌纖維 (non-fiber carbohydrates/neutral detergent fiber, NFC/NDF)的比值不僅能準確反映日糧的碳水化合物的結(jié)構(gòu)，也是反映反芻動物瘤胃亞急性酸中毒(subacuteruminal acidosis，SARA)的重要指標[12]。然而，目前還未見國內(nèi)外有關(guān)于日糧NFC/NDF是否影響EFE的作用效果的報道。

本試驗利用體外產(chǎn)氣法，在不同NFC/NDF的底物條件下，研究不同添加量的EFE對底物的產(chǎn)氣特性、降解特性和發(fā)酵特性變化的影響，進一步探究日糧結(jié)構(gòu)與EFE是否存在互作效應，以期找出不同碳水化合物組成條件下適宜的EFE添加水平，為EFE在山羊日糧中的合理應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 底物及復合纖維素酶

底物由精料和粗料兩部分組成，粗料為苜蓿(Medicagospp.)草粉和玉米(Zeamays)青貯飼料(2015年7月采集于四川省樂至縣天龍農(nóng)牧科技有限公司)，配制混合底物前將粗料在60 ℃下烘48 h，過1 mm篩后與精料配合成NFC/NDF分別為0.85、1.02、1.19、1.36和1.53的混合底物，原料的各營養(yǎng)指標均為實測值，底物原料組成和營養(yǎng)成分見表1。

表1 試驗底物組成及營養(yǎng)成分Table 1 Ingredients and chemical composition

注：原料組成為風干基礎，營養(yǎng)成分為干物質(zhì)基礎。

Note: Ingredient composition with air dried basis and nutrient composition with DM basis.

EFE為纖維素酶和木聚糖酶的復合粉劑，購自上海尤特爾生化有限公司。試驗前，參照Colombatto等[13]的方法測定了外源酶的纖維素酶和木聚糖酶活力：在pH為5.5和39 ℃條件下，纖維素酶和木聚糖酶活力分別為8563.50 IU/g和3585.6 IU/g。

1.2 瘤胃液采集

2015年9月在四川省樂至縣天龍農(nóng)牧科技有限公司種羊場選取6只體重接近[(25±0.32) kg]的健康川中黑山羊(樂至型)育肥公羊，在精粗比為50∶50的日糧條件下飼喂兩個月后，于晨飼前屠宰取瘤胃液。將每頭羊瘤胃液混合并用6層0.125 mm紗布過濾后立即裝入保溫瓶中通入CO2保持厭氧條件，迅速帶回實驗室進行體外產(chǎn)氣試驗。

1.3 試驗設計

采用2因子5水平試驗設計，底物的NFC/NDF和EFE添加水平作為兩個試驗因素。 NFC/NDF分別為0.85、1.02、1.19、1.36和1.53，EFE添加量分別為：0, 2, 4, 8和16 mg/g DM，即底物纖維素酶活力含量分別為0, 17, 34, 68, 136 IU/g DM；木聚糖酶活力含量分別為0, 7, 14, 28, 56 IU/g DM。試驗共25個處理，每個處理3個重復。

1.4 體外產(chǎn)氣試驗

參照Menke[14]的方法配制緩沖液，將其置于39.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，持續(xù)通入CO2，現(xiàn)配現(xiàn)用。準確稱取500 mg EFE 溶于緩沖液中(pH=6.5)，用玻璃棒攪拌均勻，配制成濃度為5 mg/mL的酶溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，試驗前將酶溶液放入恒溫水浴鍋中37 ℃水浴30 min。分別準確稱取700 mg底物并用移液槍吸取相應量的酶液置于100 mL玻璃刻度注射器底部(成都圣欣科學儀器有限公司)，然后吸入50 mL預先于39.5 ℃恒溫水浴鍋保溫的混合培養(yǎng)液[瘤胃液∶人工唾液=1∶4(V/V)]，輕微震蕩搖勻后置于(39±0.5) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每個處理3個重復，設置一個空白對照管(僅含有混合培養(yǎng)液)以減少系統(tǒng)誤差；每個重復設置3個平行，發(fā)酵結(jié)束后將同一個處理的3個平行樣品中的液相和固相分別混合后取樣，以防止剩余的干物質(zhì)量不足以測定后續(xù)指標。

發(fā)酵過程中，記錄3, 6, 9, 12, 18, 24, 30, 36, 40, 48 h時間點的產(chǎn)氣量，記錄過程中每間隔2 h搖勻一次(由于劇烈發(fā)酵后會出現(xiàn)固液相分開的現(xiàn)象)，產(chǎn)氣量刻度超過80 mL后推動活塞至初始刻度。培養(yǎng)48 h后立即用冰水浴終止發(fā)酵，將同一個處理的3個平行樣品中的培養(yǎng)液無損的移至50 mL離心管中，立即用PHB-5型便攜式pH計(杭州天威工貿(mào)有限公司)測定培養(yǎng)液pH值；然后吸取1 mL培養(yǎng)液進入2 mL EP 管中加入1 mL 100 g/L的偏磷酸用于揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids,VFA)含量的測定(氣相色譜外標法，日本島津CMG-QP2010，色譜柱CP-WAX：長 30 m，內(nèi)徑 0.53 mm，膜厚 1 μm)，乙酸、丙酸及正丁酸標準品(色譜純)均購于Sigma公司；另取1 mL培養(yǎng)液加入1 mL 0.5 mol/L的HCl用于氨態(tài)氮(NH3-N)含量的分析(分光光度計購自上海安譜科學儀器有限公司，DR/5000)。最后將離心管于3000 r/min下離心15 min，并用熱水洗滌培養(yǎng)液固相殘留物，然后無損的轉(zhuǎn)移至預先恒重的輕質(zhì)鋁盒中，于65 ℃烘箱中烘48 h，然后將同一處理的3個平行風干樣混合，用于干物質(zhì)消失率(dry matter disappearance rate, DMD)、酸性洗滌纖維降解率(acid detergent fiber degradation rate, ADFD)、中性洗滌纖維降解率(neutral detergent fiber degradation rate, NDFD)和氮降解率(nitrogen degradation rate, ND)的測定。

1.5 指標測定及計算方法

各處理底物和培養(yǎng)液固相殘留物中DM、Ash和N含量的測定參照張麗英[15]的方法， ADF和NDF含量參照Van Soest等[16]的方法進行測定。培養(yǎng)液中VFA和NH3-N含量參照Carro等[17]的方法測定。

其中VFA測定的色譜條件：載氣為氦氣，流量為2 mL/min，分流比為10∶1。采用程序升溫，初始溫度為120 ℃，以8 ℃/min升溫至180 ℃，保持5 min，離子源溫度為230 ℃。進樣口溫度為210 ℃，進樣量為1 μL。

1.5.1 產(chǎn)氣量的計算

產(chǎn)氣量(mL)=該時間段內(nèi)培養(yǎng)管產(chǎn)氣量(mL)-對應空白管產(chǎn)氣量(mL)

1.5.2 產(chǎn)氣動力學參數(shù) 參照France等[18]提出的計算模型:GP=b×[1-e-c(t-L)]，調(diào)用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件中非線性回歸程序(Nonlinear)進行產(chǎn)氣參數(shù)估計。式中：GP表示培養(yǎng)t時間點的產(chǎn)氣量(mL)，e為自然對數(shù)，t為培養(yǎng)時間(h)，b為潛在最大產(chǎn)氣量(mL/g DM)，c表示產(chǎn)氣速率(mL/h)，L表示開始產(chǎn)氣前的延滯時間(h)。

1.5.3 DMD、 ADFD、 NDFD和 ND計算方法

DMD (%)=(A-B)/A×100

式中：A為發(fā)酵前樣品干物質(zhì)重；B為發(fā)酵48 h后殘渣干物質(zhì)重。

ADFD (%)=(ADF前×A-ADF后×B)/ADF前×A×100

式中：ADF前為發(fā)酵前的ADF含量；ADF后為發(fā)酵48 h后ADF的含量；NDFD和ND的計算方法與ADFD的計算方法相同。

1.6 統(tǒng)計方法

將不同NFC/NDF水平和EFE添加水平作為兩個因素，用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件中一般線性模型(general linear models, GLM)，選用交互模型進行兩因素方差分析，分別得出兩個因素對各項體外發(fā)酵參數(shù)指標的主效應和互作效應；再調(diào)用GLM程序分別對各個底物不同酶水平進行單因素方差分析，并采用Duncan’s法進行多重比較，然后用線性估計(curve estimation)程序?qū)ο嗤孜锵虏煌杆降脑囼灲Y(jié)果進行線性(Linear)和二次函數(shù)(Quadratic)的顯著性檢驗。以P<0.05代表差異顯著性的判斷標準，結(jié)果用平均值表示，變異程度用標準誤(SEM)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外產(chǎn)氣參數(shù)

由表2可見，不同NFC/NDF底物和EFE水平對體外總產(chǎn)氣量(GP48)和產(chǎn)氣參數(shù)(b、c和L)均有顯著的影響(P<0.05)；且兩因素互作顯著(P<0.05)。相同底物條件下，底物1中， GP48、b和c值隨EFE劑量增加顯著地線性和二次提高(P<0.05)，其中以16 mg/g 水平組較高，L值則顯著地線性降低(P<0.05)，同樣以16 mg/g 水平組最低；底物2中，GP48、b和c值隨EFE劑量增加顯著地二次提高(P<0.05)，其中以4 mg/g 水平組較高，底物3和底物4呈相似的趨勢；底物5中，EFE添加水平對GP48和產(chǎn)氣參數(shù)無顯著影響(P>0.05)。

續(xù)表2 Continued Table 2

注：同列數(shù)據(jù)后所標字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標字母相同或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)。1)底物分別表示NFC/NDF為0.85、1.02、1.19、1.36和1.53。下同。

Note: Different letters in the same column mean significant differences between the treatments (P<0.05), same letter in the same column or no letter means not significant difference between treatments (P>0.05).1)The substrates showed that the NFC/NDF ratio were 0.85, 1.02, 1.19, 1.36 and 1.53, respectively. The same below.

2.2 底物降解特性

從表3可知，不同底物對DMD、ADFD、NDFD和ND均有顯著的影響(P<0.05)，除ND外，EFE水平的添加效應呈現(xiàn)相似結(jié)果。底物1條件下，隨著EFE添加劑量的提高，DMD、ADFD和NDFD顯著地線性提高(P<0.05)，其中均以16 mg/g組最高；底物2～底物4中，隨著EFE添加劑量的提高，DMD、ADFD和NDFD顯著地二次函數(shù)提高(P<0.05)，其中均以4 mg/g組最高；底物5條件下，EFE添加劑量對底物降解特性沒有顯著影響(P>0.05)。

表3 不同NFC/NDF底物條件下不同EFE水平對底物降解特性的影響Table 3 Effects of different levels of exogenous fibrolytic enzymes on the degradation characteristics of substrates with different NFC/NDF ratios %

續(xù)表3 Continued Table 3

2.3 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

由表4可看出，不同NFC/NDF底物和EFE水平對瘤胃pH、氨態(tài)氮含量、總揮發(fā)性脂肪酸(total voltatile fatty acid,TVFA)濃度、乙酸、丙酸、丁酸摩爾濃度和乙酸∶丙酸值均有顯著影響(P<0.05)，除瘤胃丙酸外，兩種因素對其他瘤胃發(fā)酵參數(shù)均有顯著的互作效應(P<0.05)。在底物1～4條件下，隨著EFE添加劑量的提高，除丙酸和丁酸外，各發(fā)酵參數(shù)顯著地線性或二次提高或降低(P<0.05)。底物1中，對照組pH值、氨態(tài)氮含量和丁酸濃度顯著高于4、8和16 mg/g組(P<0.05)，相反，16 mg/g組的TVFA和乙酸濃度顯著高于其他各組(P<0.05)，乙酸∶丙酸值同樣以16 mg/g EFE水平組較高，與4 mg/g組差異不顯著(P>0.05)；底物2、底物3和底物4條件下，pH值和氨態(tài)氮含量以4 mg/g組較低，而TVFA、乙酸摩爾濃度和乙酸∶丙酸值則呈相反的趨勢；底物5中，EFE添加劑量對發(fā)酵參數(shù)無顯著影響。

表4 不同NFC/NDF底物條件下不同外源酶水平對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 4 Effects of different levels of exogenous fibrolytic enzymes on the rumen fermentation parameters of substrates with different NFC/NDF ratios

續(xù)表4 Continued Table 4

3 討論

3.1 不同NFC/NDF的底物條件下EFE水平對體外產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣參數(shù)和底物降解特性的影響

反芻動物瘤胃內(nèi)含有能分解纖維類物質(zhì)的極為復雜的微生物體系，微生物在發(fā)酵飼糧后會代謝產(chǎn)生由CH4、NH3、CO2、H2和N2等組成的混合氣體，故產(chǎn)氣量綜合體現(xiàn)了發(fā)酵底物被微生物利用的程度。許多研究表明，在反芻動物日糧中添加外源酶制劑，可以促進酶與底物結(jié)合，從而提高飼料的利用率[19-21]。但對EFE能否提高或者降低GP，報道的結(jié)果卻不盡相同。Eun等[20]的體外發(fā)酵研究結(jié)果顯示，在苜蓿干草中添加內(nèi)切及外切葡聚糖酶、木聚糖酶以及蛋白酶均能促進苜蓿干草的GP48累積，同時還提高了苜蓿干草的DMD及纖維降解率。Yang等[22]利用體外發(fā)酵研究外源酶制劑對以苜蓿和稻草秸稈為發(fā)酵底物的降解率的影響，結(jié)果表明，與對照組相比，添加酶制劑可以提高48 h的總GP，并能促進DM和纖維的降解。本研究中，在各底物條件下，EFE水平對GP48、體外潛在最大產(chǎn)氣量(b值)和產(chǎn)氣速率(c值)均有顯著的線性或二次函數(shù)的影響，但趨勢不盡相同，隨著EFE添加量的遞增，GP出現(xiàn)先增加后減少的趨勢，即EFE水平過高GP48反而降低，這正如Elghandour等[23]的觀點所述，只有適宜的EFE添加水平方能提高瘤胃發(fā)酵效率。而Nsereko等[24]認為在同樣飼糧條件下，適宜的EFE水平能改善瘤胃的發(fā)酵效率或刺激瘤胃良性發(fā)酵，從而提高GP、c值及底物降解率。但也有研究認為酶制劑的添加對產(chǎn)氣量幾乎沒有影響[18]。產(chǎn)生不一致的原因可能是酶添加劑量的不同以及適合與不同底物所匹配的酶不一樣。

盡管反芻動物瘤胃微生物能分泌大量可以破壞纖維素及半纖維素中糖苷鍵的酶，但許多研究均證實添加EFE可提高纖維的降解[21]。從本試驗中GP48的差異便可推知，與對照組相比，添加EFE可促進纖維降解。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，當NFC/NDF=0.85時，添加16 mg/g的EFE具有較高的GP和纖維降解率，而底物NFC/NDF分別為1.02、1.19、1.36時，添加4 mg/g EFE則效果更好，這表明底物NFC/NDF與EFE的添加水平存在互作效應。其原因則要追溯到EFE的作用機理上，EFE對纖維素進行降解首先要吸附到纖維素上，纖維素酶分子通過纖維素結(jié)合域吸附到纖維素晶體表面，然后催化結(jié)構(gòu)域催化糖苷鍵的斷裂從而實現(xiàn)纖維素的降解。而NDF含量高的底物具有較大的纖維素晶體表面積，從而可吸附更多的纖維素結(jié)合域，因此有更高水平的纖維素酶能發(fā)揮作用[25]。此外，本試驗中，在不同底物里添加EFE對ND無顯著影響。此結(jié)果與Awawdeh等[26]報道的在羔羊飼糧中添加EFE，對羔羊氮利用率和氮沉積率無影響的結(jié)果一致。相反，Gado等[19]在奶牛的飼喂試驗中得出不同的結(jié)果，在奶牛飼糧中添加40 g/d的EFE，提高了飼糧N利用率。造成這些結(jié)果不一致的原因可能是纖維素酶的來源不同(Gado等[19]所使用的EFE為瘤胃厭氧菌培養(yǎng)產(chǎn)生)，還可能與動物品種差異有關(guān)，因此在具體應用時，要根據(jù)酶制劑和動物類型進行合理選擇。

3.2 不同NFC/NDF的底物條件下EFE對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

pH值是反應反芻動物瘤胃發(fā)酵水平最直觀指標，大量研究證實，瘤胃液中VFA濃度的增加是導致pH下降的主要因素，其次為乳酸[27-28]。本試驗研究表明，在底物1～4條件下，TVFA濃度隨EFE水平的提高呈線性或二次函數(shù)升高的趨勢，這可能是導致pH值線性或二次降低的原因，本試驗中底物1～4條件下，培養(yǎng)液pH值在5.83～6.52，而高于亞急性瘤胃酸中毒(SARA)5.5～5.8的閥值[29]，而在底物5中，pH值在5.73～5.88，接近SARA閥值，原因可能是本試驗采用的體外培養(yǎng)裝置不是連續(xù)型培養(yǎng)系統(tǒng)，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)管內(nèi)VFA和乳酸等物質(zhì)積累而無法吸收和排出導致pH值處于較低的水平。另外，TVFA的濃度的高低依賴于底物碳水化合物的結(jié)構(gòu)和降解程度，在同樣的NFC/NDF條件下，本試驗中EFE水平影響了DMD、ADFD和NDFD，故影響了TVFA，這與Arriola等[30]的結(jié)果一致，而不同的底物條件下的TVFA結(jié)果和相應降解特性結(jié)果相吻合，即底物1條件下，以16 mg/g EFE水平組較高，底物2～4以4 mg/g酶水平較高。對于單VFA，除底物5外，其余底物處理組中，乙酸摩爾濃度的變化趨勢與TVFA基本一致，丁酸呈相反趨勢，而丙酸摩爾濃度未發(fā)生顯著變化，導致乙酸∶丙酸值出現(xiàn)相應的變化，即隨著底物碳水化合物降解率的提高，VFA中乙酸比例提高，丙酸不變，丁酸比例降低，乙酸∶丙酸值提高，可見，酶水平改變了瘤胃的發(fā)酵模式，這與Giraldo等[31]和Romero等[32]報道的結(jié)果一致。

值得注意的是，當NFC/NDF=1.53(底物5)時，酶水平未影響底物產(chǎn)氣特性、降解特性和發(fā)酵特性，這可能是當NFC/NDF提高到一定值時，快速發(fā)酵的碳水化合物含量過高，迅速發(fā)酵后促使培養(yǎng)液pH快速降低從而抑制了纖維類降解菌的生長[33]，而同時外源纖維素酶吸附到結(jié)構(gòu)性碳水化合物上后首先催化致密的纖維結(jié)構(gòu)變得疏松而部分水解，但水解產(chǎn)物并沒有完全被降解纖維類的微生物所利用，而影響了產(chǎn)氣特性和降解特性。瘤胃中氨氮濃度是反應飼糧代謝的重要指標，是瘤胃微生物可利用的主要氮源，在同樣的日糧蛋白質(zhì)水平下，瘤胃中氨態(tài)氮濃度越低表征微生物利用率越高，菌體蛋白產(chǎn)量越高[34]。本試驗結(jié)果表明，各NFC/NDF的底物條件下，瘤胃液中氨態(tài)氮含量變化趨勢與相應TVFA的趨勢一致，即底物1條件下呈線性和二次函數(shù)降低的趨勢，以16 mg/g 外源酶水平組最低，底物2～4均以4 mg/g酶水平較低，說明瘤胃氨態(tài)氮的利用率分別在上述酶水平條件下較高，原因可能是適宜的酶水平提高了結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解率，從而產(chǎn)生較高的TVFA濃度，為微生物的生長提供更多的可利用能進而提高了氨態(tài)氮利用率[35]。

4 結(jié)論

本試驗條件下， NFC/NDF底物影響了EFE的添加效應，NFC/NDF=0.85時，16 mg/g EFE水平組有較好纖維降解效果；NFC/NDF分別為1.02、1.19和1.36時，EFE最適添加劑量為4 mg/g；NFC/NDF=1.53時，底物中添加EFE沒有正面效應。

References：

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Determination of appropriate levels of exogenous fibrolytic enzyme supplementation for substrates with different non-fiber carbohydrate/neutral detergent fiber ratios based oninvitrogas production

CHEN Guang-Ji1,2, SONG Shan-Dan1, PENG Zhong-Li1*,WANG Pu-Chang2, WU Jia-Hai2, WANG Xiao-Li2, GUO Chun-Hua1, WANG Zi-Yuan2, GAO Yan-Hua1, LI Xiao-Dong2, BAI Xue1, FU Xi-San3

1.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestMinzuUniversity,Chengdu610041,China; 2.GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China; 3.BureauofScienceandTechnology,SichuanProvince,Lezhi641500,China

The objective of this study was to determine the appropriate level of exogenous fibrolytic enzyme (EFE) supplementation for substrates with different non-fiber carbohydrates/neutral detergent fiber (NFC/NDF) ratios. The experiment had a cross group design with two factors and five levels. Five substrates with different NFC/NDF ratios (0.85, 1.02, 1.19, 1.36, and 1.53; sub1-5) were supplemented with EFE at five levels (0, 2, 4, 8, and 16 mg/g dry matter/DM) andinvitrogas production, degradation, and fermentation profiles were determined. The results can be summarized as follows: 1) The NFC/NDF ratio influenced totalinvitrogas production (GP48) and gas production parameters (b, c, and L) (P<0.05). The interaction between NFC/NDF ratio and EFE level was significant for gas production parameters (P<0.05).In sub1, as the EFE level increased, GP48, b, and c increased (linear and quadratic effect,P<0.05), and the highest GP48, b, and c were in the 16 mg/g EFE treatment; L showed the opposite trend. In the sub2-4 treatments, the highest GP48, b, and c were in the 4 mg/g EFE treatment. 2) The NFC/NDF ratio in the substrate significantly affected the dry matter disappearance rate (DMD), acid detergent fiber degradation rate (ADFD), neutral detergent fiber degradation rate (NDFD), and nitrogen degradation rate (ND) (P<0.05). The additive effects of EFE produced similar results, except for ND. In sub1, as the EFE dose increased, DMD, ADFD, and NDFD linearly increased (P<0.05). The maximum values of DMD, ADFD, and NDFD were in the 16 mg/g EFE treatment in sub1 and in the 4 mg/g EFE treatment in sub2-4 (P<0.05). 3) The fermentation profile differed significantly among substrates with different NFC/NDF ratios and different levels of EFE supplementation (P<0.05), and the two factors had a significant interaction effect (P<0.05) for all fermentation parameters, except for propionate. For sub1-4, as the EFE levels increased, the fermentation profiles of all parameters except for propionate increased or decreased (quadratic effect,P<0.05). In sub1, pH, ammonia-N, and the butyrate molar concentration were higher in the control group than in the 4, 8 and 16 mg/g EFE treatments, but the acetate molar concentration and acetate∶propionate ratio were higher in the 16 mg/g EFE treatment. The sub2-4 treatments showed lower pH and ammonia-N, and higher total volatile fatty acid (TVFA), acetate molar concentration, and acetate∶propionate ratio. 4) In the substrate with NFC/NDF=1.53, EFE supplementation had no effect oninvitrogas production, fiber degradation, or fermentation characteristics (P>0.05). The results of this study showed that the NFC/NDF ratio influenced the response to EFE supplementation; NFC/NDF=0.85, 16 mg/g EFE showed the best fiber degradation, and the optimum EFE dose was 4 mg/g for substrates with NFC/NDF ratios of 1.02, 1.19, and 1.36. There was no positive effect of EFE on the substrate with NFC/NDF=1.53.

invitrogas production; NFC/NDF; exogenous fibrolytic enzymes; appropriate supplementary dose

10.11686/cyxb2017055

2017-02-20；改回日期：2017-04-10

“科技部科技富民強縣專項：川中黑山羊(樂至型)健康養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)集成與示范”，科技創(chuàng)新人才團隊建設項目“貴州省喀斯特山區(qū)草地培育與養(yǎng)殖管理科技創(chuàng)新人才團隊”(黔科合平臺人才[2016]5617)和黔科合重大專項字(2014)6017號資助。

陳光吉(1990-)，男，貴州遵義人，碩士。E-mail:cgjgz09@126.com

*通信作者Corresponding author. E-mail: leo3131@163.com

http://cyxb.lzu.edu.cn

陳光吉, 宋善丹, 彭忠利, 王普昶, 吳佳海, 王小利, 郭春華, 王子苑, 高彥華, 李小冬, 柏雪, 付錫三. 體外產(chǎn)氣法研究不同NFC/NDF底物條件下外源纖維素酶的適宜添加水平. 草業(yè)學報, 2017, 26(7): 116-127.

CHEN Guang-Ji, SONG Shan-Dan, PENG Zhong-Li, WANG Pu-Chang, WU Jia-Hai, WANG Xiao-Li, GUO Chun-Hua, WANG Zi-Yuan, GAO Yan-Hua, LI Xiao-Dong, BAI Xue, FU Xi-San. Determination of appropriate levels of exogenous fibrolytic enzyme supplementation for substrates with different non-fiber carbohydrate/neutral detergent fiber ratios based oninvitrogas production. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 116-127.