飼糧添加苜蓿黃酮對奶牛瘤胃菌群的影響

占今舜，鄔彩霞，劉明美,3，蘇效雙，詹康，趙國琦*

(1.揚州大學動物科學技術學院，江蘇 揚州 225009；2.江西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；3.江蘇聯合職業(yè)技術學院淮安生物工程分院,江蘇 淮安 223200)

?

飼糧添加苜蓿黃酮對奶牛瘤胃菌群的影響

占今舜1,2，鄔彩霞1，劉明美1,3，蘇效雙1，詹康1，趙國琦1*

(1.揚州大學動物科學技術學院，江蘇 揚州 225009；2.江西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；3.江蘇聯合職業(yè)技術學院淮安生物工程分院,江蘇 淮安 223200)

本試驗旨在研究苜蓿黃酮對奶牛瘤胃菌群結構和組成的影響。選取4頭裝有瘺管的頭胎荷斯坦奶牛，試驗采用4×4拉丁方設計，每頭奶牛每天飼喂全混合飼糧(TMR)，其中分別添加0 g(A組)、20 g(B組)、60 g(C組) 和 100 g(D組)苜蓿黃酮。試驗分為4期，每期24 d。每期采集瘤胃液，提取總DNA后在Illumina MiSeq 平臺上進行測序。結果為：1)4個處理組共產生52747個OTU，共享16142個OTU，占總OTU數量的30.60%，其中試驗A組的OTU數量最高。2)Shannon指數隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高呈先上升后下降的趨勢，試驗C組的Simpson指數顯著高于試驗D組和A組(P<0.05)，但各處理組間的ACE和Chao 1指數無顯著性差異。3)各試驗組間的細菌門的數量沒有顯著性差異，但試驗C組的細菌屬的數量顯著高于試驗B組和試驗A組(P<0.05)。在門水平上，SR1門相對豐度隨著苜蓿黃酮添加水平的升高呈線性升高的趨勢(0.05

苜蓿；黃酮類化合物；微生物；瘤胃；奶牛

反芻動物瘤胃是一個厭氧的生態(tài)系統，里面存在大量的細菌、原蟲、真菌和古生菌等微生物，它是一個自然纖維素降解系統[1]。因此，研究瘤胃中的微生物種類和數量的改變有助于了解反芻動物消化代謝的作用機理。黃酮類化合物是植物次生代謝產物，廣泛存在于植物中[2]。苜蓿(Medicagosativa)中含有豐富的蛋白質、維生素等營養(yǎng)物質，被廣泛應用在奶牛生產中。黃酮類物質是苜蓿草中含量比較豐富的次生代謝產物，其在提高奶牛生產中可能發(fā)揮著重要的作用。Orhana 等[3]發(fā)現，黃酮類化合物能夠抑制綠農假單胞菌、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等細菌和克魯斯假絲酵母等真菌以及病毒。研究發(fā)現，富含黃酮化合物的印度苦楝樹(Azadirachtaindica)種子提取物和意大利薊(Carduuspycnocephalus)葉子提取物能夠降低瘤胃原蟲的數量，而含黃酮化合物的問荊草(Equisetumarvense)提取物、貫葉金絲桃(Hypericumperforatum)花提取物和鼠尾草(Salviajaponica)葉提取物對原蟲的數量沒有影響[4-6]。另外，據Oskoueian等[7]研究報道，黃酮、楊梅酮、兒茶素、蘆丁和山奈酚能夠降低瘤胃微生物數量，柚皮苷和槲皮素能夠抑制產甲烷菌和原蟲。以上結果表明，黃酮類化合物能夠調節(jié)瘤胃微生物菌群，而且不同來源和結構的黃酮類化合物對瘤胃微生物的影響結果不同。目前，苜蓿黃酮對奶牛瘤胃微生物的影響研究尚未見報道。研究微生物生態(tài)學的方法有很多，高通量測序技術由于其能全面地反映樣品微生物結構的優(yōu)點，而被廣泛應用于研究反芻動物瘤胃微生物[8]。因此，本試驗通過16s DNA高通量測序方法研究苜蓿黃酮對奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響，探討苜蓿黃酮是如何改變微生物區(qū)系來影響瘤胃的消化代謝，為苜蓿黃酮的應用提供一些參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗設計和飼養(yǎng)管理

試驗于2015年4月在上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司星火奶牛二場進行。選取4頭裝有瘤胃、小腸和回腸瘺管的頭胎荷斯坦奶牛[平均體重為(500±25) kg，泌乳天數為(79±6) d]，試驗采用4×4拉丁方設計，每頭奶牛每天飼喂全混合飼糧(total mixed ration,TMR)中分別添加0 g(A組)、20 g(B組)、60 g(C組) 和 100 g(D組)的苜蓿黃酮(含量為50%，由陜西綠清生物工程有限公司提供)作為試驗處理。進行4期動物飼養(yǎng)試驗，每期為24 d，其中預飼期為10 d。奶牛采用拴式飼養(yǎng)方式，自由飲水，每天飼喂3次，分別為06:30、13:30 和19:30，每日擠奶3次，時間分別為10:00、16:00和22:00。飼糧配方及營養(yǎng)水平見表1。粗蛋白、纖維和鈣、磷等參照張麗英[9]的方法進行檢測，產奶凈能參照楊鳳[10]的方法進行計算。

1.2 樣品采集

每個試驗期的第18天，在晨飼前半個小時打開牛瘤胃瘺管采集瘤胃液。在瘤胃的前后、左右采集瘤胃內容物，然后將內容物經過4層紗布過濾獲得瘤胃液。將瘤胃液裝入凍存管中，放在液氮中凍存，后轉移到-80 ℃進行保存。

1.3 瘤胃微生物DNA提取

將瘤胃液放在超純水中進行解凍，吸取300 μL的瘤胃液進行微生物DNA的提取。提取方法參照試劑盒(TIANamo Stool DNA Kit，天根)上的說明書進行，將提取的DNA 樣品在Qubit 2.0 熒光光度計(Invitrogen，美國)上進行濃度的測定，并用0.8%瓊脂糖凝膠進行純度的檢測。取5～50 ng瘤胃微生物總DNA，用MetaVxTM文庫的制備試劑盒進行文庫的制備(GENEWIZ，美國)。根據金唯智公司自主合成的V3、V4和V5區(qū)引物進行測序。設計通用引物如表2 所示。

第一次PCR擴增采用25 μL反應體系，體系組成為：TransStart Buffer (10×)，2.5 μL；TransStart Taq (2.5 U/μL)，0.5 μL；dNTPs (2.5 mmol/L)，2.0 μL；(3+8) primer mix (1×)，2.5 μL；DNA(30～50 ng)，3.0 μL；Molecular water，14.5 μL。擴增反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性5 s，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸10 s，進行14個循環(huán)，最后72 ℃ 延伸 5 min，10 ℃ 保存。第二次PCR擴增采用50 μL反應體系，體系組成為：TransStart Buffer (10×)，2.5 μL；TransStart Taq (2.5 U/μL)，0.5 μL；dNTPs (2.5 mmol/L)，2.0 μL；primer cocktail (1×)，4.0 μL；D50×/D70×，6.0 μL；Molecular water，10.0 μL；(3+8) amplification production，25.0 μL。擴增反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，進行10個循環(huán)，最后72 ℃ 延伸 5 min，10 ℃ 保存。PCR產物經過質量檢測后，根據說明書上所記載的步驟，在Illumina MiSeq儀器上進行DNA文庫的構建，然后使用2×250 或 2×300雙端進行測序。

表1 飼糧組成和營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Nutrient level and composition of feed (dry matter basis)

1) 精料補充料包含Concentrate supplement contained：玉米Corn 158.30 g/kg，豆粕Soybean meal 35.30 g/kg，大豆皮Soybean hull 52.90 g/kg，酒糟Distillers dried grains with soluble 54.90 g/kg，啤酒糟Brewer’s grain 16.70 g/kg，食鹽Sodium chloride 2.20 g/kg，碳酸鈣Calcium carbonate 3.50 g/kg，碳酸氫鈣Calcium hydrophosphate 4.40 g/kg，碳酸氫鈉Sodium bicarbonate 3.30 g/kg.

2) 預混料每kg含The premix contained the following per kg of diets：維生素A Vitamin A 3000 IU，維生素D Vitamin D 31400 IU，維生素E Vitamin E 30 IU，鐵Iron 100 mg，銅Copper 10 mg，鋅Zinc 35 mg，錳Manganese 20 mg，碘Iodine 0.30 mg，硒Selenium 0.10 mg，鈷Cobalt 0.08 mg.

3) 產奶凈能為計算值，其他為實測值。 Net energy for lactation was calculated and the others were measured.

表2 V3、V4和V5區(qū)引物序列Table 2 Sequence of primer for V3, V4 and V5

1.4 數據分析

通過軟件CASAVA(V1.8.2)，對測序結果原始圖像數據進行圖像堿基識別，經過質量分析，得到測序數據。通過軟件Qiime(v1.7)，使用 UCLUST方法進行operational taxonomic unit(OTU)聚類，對在97%的相似水平下所有序列進行OTU劃分并進行生物信息統計分析。然后根據ACE(http://www.mothur.org/wiki/Ace)和Chao(http://www.mothur.org/wiki/Chao)指數來分析環(huán)境群落的物種豐度，根據Simpson(http://www.mothur.org/wiki/Simpson)和Shannon(http://www.mothur.org/wiki/Shannon)指數分析群落的多樣性。通過weighted uniFrac距離矩陣進行 PCoA 作圖分析，使用 UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)聚類方法，基于 weighted unifrac距離矩陣，將樣品進行聚類。

α多樣性等數據采用SAS 9.2軟件的 PROC GLM 程序進行方差分析。分析模型為Yijkl=μ+Pi+Cj(l)+Tk+Eijk，其中Yijkl為因變量值，μ為總體均值，Pi為試驗期效應(i=1～4)，Cj(l)為第l拉丁方內第j試驗奶牛的隨機效應(j=1～4)，Tk為飼糧處理效應(k=1～4)，Eijk為隨機誤差。數據采用線性和二次線性回歸分析以及Duncan法進行多重比較，P≤0.05 表示差異顯著，而0.05

2 結果與分析

2.1 苜蓿黃酮對細菌豐富度和多樣性的影響

試驗4期16個樣品共產生2771189條有效序列，經過優(yōu)化后得到2487653條優(yōu)質序列，平均序列長度為437 nt。試驗A組的有效序列和優(yōu)質序列均最高，隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高，有效序列和優(yōu)質序列呈先降低后升高趨勢(表3)。從圖1可知，各試驗組的樣品稀釋曲線趨于平緩，隨著測序深度的增加，OTU數量將不再增加，說明測序數量比較合理?；?7%相似性的原則進行OTU分析(圖2)，4個處理組共產生52747個OTU，各組分別產生OTU數量為36421(A)、34185(B)、34756(C)和36310(D)，其中共享16142個OTU，占總OTU數量的30.60%。從表3中可知，各組的ACE和Chao1指數無顯著性差異，說明苜蓿黃酮對細菌豐度無顯著影響。隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高，Shannon指數呈先上升后下降的趨勢；試驗C組的Simpson指數顯著高于試驗D組和A組(P<0.05)，且隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高呈先上升后降低趨勢；試驗C組細菌屬的數量顯著高于試驗B組和A組(P<0.05)。說明苜蓿黃酮能夠影響細菌的多樣性。

表3 苜蓿黃酮對細菌豐富度和多樣性的影響Table 3 Effect of flavonoids from alfalfa on the richness and diversity of microbe

注：ACE和Chao1指數表示細菌豐富度，香濃和辛普森指數表示細菌的多樣性。A、B、C和D表示試驗組分別為0,20,60和100 g苜蓿黃酮組。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note: ACE and Chao1 indexes show the richness of microbe; Shannon and Simpson indexes show the diversity of microbe. A, B, C and D show the experimental groups with 0, 20, 60 and 100 g alfalfa flavonoids, respectively. In the same row, values with different lowercase letters mean significant differences (P<0.05), the same letter or no letter mean no significant differences (P>0.05).The same below.

圖1 各個樣品的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of all samples

圖2 OTU 維恩圖Fig.2 OTU venn

表4 苜蓿黃酮對細菌組成和結構的影響(門水平)Table 4 Effect of flavonoids from alfalfa on composition and structure of microbe (at the phyla level) %

表5 苜蓿黃酮對細菌組成和結構的影響(屬水平)Table 5 Effect of flavonoids from alfalfa on composition and structure of microbe (at the genus level) %

2.2 苜蓿黃酮對細菌組成和結構的影響

在門水平上(表4)，隨著苜蓿黃酮的添加水平的升高，SR1門相對豐度呈線性升高趨勢(0.05

2.3 聚類分析

通過主坐標分析可知(圖3)，各試驗組的樣品均能很好地分開，對各試驗組進行聚類分析(圖4)，發(fā)現試驗A和B組細菌群落結構比較相似，試驗C和D組細菌群落結構比較相似。結果說明，苜蓿黃酮對瘤胃菌群結構具有影響作用。

圖3 PcoA分析Fig.3 Analysis by principal co-ordinate analysis

圖4 UPGMA 聚類樹分析Fig.4 Analysis by UPGMA tree

3 討論

高通量測序技術可以快速、高效地了解瘤胃微生物群落結構和種類，已廣泛應用于研究反芻動物瘤胃微生物菌群[11-12]。黃酮類化合物具有抑制細菌生長的作用，而瘤胃微生物生態(tài)群落比較復雜，因此，通過高通量測序技術可以更全面地了解苜蓿黃酮對瘤胃微生物區(qū)系的影響。

Shannon和Simpson指數是用來估算微生物多樣性的指標。Simpson指數值越大，說明群落多樣性越高；Shannon指數越大，說明群落多樣性越高。在本試驗中，Shannon和Simpson指數隨苜蓿黃酮添加劑量的升高呈先上升后降低的趨勢。另外，細菌屬的數量隨苜蓿黃酮添加水平的升高而呈先升高后降低的趨勢。結果說明，瘤胃細菌的多樣性隨苜蓿黃酮添加水平(20～60 g)的升高而升高，但添加100 g時，瘤胃細菌的多樣性下降。研究發(fā)現，黃酮類化合物能夠通過抑制細菌核酸的合成和破壞細菌細胞膜，進而產生抗菌作用[13]。而且，黃酮的抑菌作用隨著濃度增加而增強[14]。因此，苜蓿黃酮添加劑量超過60 g，降低瘤胃細菌多樣性的原因可能是黃酮濃度高，發(fā)揮強抑菌和殺菌作用，進而降低瘤胃中細菌的種類和多樣性。0 g組和20 g組細菌門的數量和屬的數量比較接近，60 g組和100 g組細菌門的數量和屬的數量比較接近。因此，0 g組和20 g組細菌群落的結構相似度比較高，60 g組和100 g組的細菌群落的結構相似度比較高。

Kim等[15]研究發(fā)現，反芻動物瘤胃微生物的厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)數量最多，占細菌總門數量的91%。另外，對安格斯西口塔爾公牛和水牛瘤胃微生物宏基因組研究結果與其相似[16-17]。本試驗得出相似的結果。互養(yǎng)菌門是一類革蘭氏陰性厭氧細菌，廣泛存在于動物腸道、土壤等厭氧環(huán)境中[18]。在本試驗中，低濃度的苜蓿黃酮互養(yǎng)菌門相對豐度低，且隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高其相對豐度呈升高趨勢。出現這種情況可能是高濃度苜蓿黃酮能夠抑制與其發(fā)生競爭、拮抗細菌的生長，進而促進互養(yǎng)菌門細菌的生長，而低劑量發(fā)揮抑制的效果較弱所致。在本試驗中，SR1門相對豐度隨苜蓿黃酮添加劑量的升高呈線性升高趨勢?？赡苁屈S酮類化合物抑制了與其競爭、拮抗的細菌，進而促進其生長。

在屬水平上，普雷沃菌屬為反芻動物瘤胃微生物的優(yōu)勢菌屬，其幾乎可以單獨完成或參與瘤胃內所有飼糧成分的降解[9]。從試驗結果來看，苜蓿黃酮在一定程度上可能會有提高瘤胃普雷沃菌屬數量的作用。從本試驗中可知，飼糧中添加苜蓿黃酮能夠提高厚壁菌門，毛螺菌科的毛螺菌屬、假丁酸弧菌屬和Shuttleworthia屬的相對豐度，而這些屬的細菌能夠發(fā)酵碳水化合物。但是苜蓿黃酮可能會對該科下的Blautia屬和Marvinbryantia屬產生抑制作用。結果說明苜蓿黃酮可能會影響飼料中的碳水化合物的消化和代謝。厭氧弧菌屬能夠水解甘油三酯產生甘油和脂肪酸，并將甘油轉化成丙酸和琥珀酸。從本試驗的結果來看，苜蓿黃酮可能會對飼料中脂肪的消化和代謝具有影響作用，但添加劑量升高，作用會降低?；ヰB(yǎng)菌屬(Synergistes)是一種新發(fā)現的細菌屬，從反芻動物中分離出的能夠以精氨酸和組氨酸作為底物，降解動物飼料中的毒素，幫助動物生存[19]。從本試驗中可知，瘤胃互養(yǎng)菌屬相對豐度隨飼糧中添加苜蓿黃酮劑量的升高呈升高趨勢，說明苜蓿黃酮可能有助于降低飼料中的毒素進而可能影響奶牛的生產性能。錐形桿菌屬(Pyramidobacter)是最近幾年剛發(fā)現的新菌屬，通過培養(yǎng)其主要終末代謝產物是乙酸、少量的異戊酸和痕跡量到少量的丙酸、異丁酸、琥珀酸、苯乙酸[20]。從本試驗中可知，苜蓿黃酮可能具有抑制該菌屬的作用，從而會影響瘤胃乙酸的生成。

4 結論

1)飼糧中添加苜蓿黃酮能夠影響瘤胃細菌屬的數量和細菌的多樣性，但對細菌豐富度沒有影響。

2)在門水平上，隨著苜蓿黃酮添加量的升高能夠提高SR1門和互養(yǎng)菌門細菌相對豐度的趨勢。在屬水平上，苜蓿黃酮能提高SP3-e08屬、U29-B03屬、互養(yǎng)菌屬、厭氧弧菌屬和Shuttleworthia屬細菌的相對豐度，而能夠降低錐形桿菌屬、Marvinbryantia屬和Blautia屬細菌的相對豐度。

References：

[1] Yue Z B, Li W W, Yu H Q. Application of rumen microorganisms for anaerobic bioconversion of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, 2013, 128: 738-744.

[2] Hossain M A, Kalbani M S, Farsi S A,etal. Comparative study of total phenolics, flavonoids contents and evaluation of antioxidant and antimicrobial activities of different polarities fruits crude extracts ofDaturametelL. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 2014, 4(5): 378-383.

[3] Orhana D D, ?z?elik B, ?zgen S,etal. Antibacterial, antifungal, and antiviral activities of some flavonoids. Microbiological Research, 2010, 165: 496-504.

[4] Patra A K, Kamra D N, Agarwal N. Effect of plant extracts oninvitromethanogenesis, enzyme activities and fermentation of feed in rumen liquor of buffalo. Animal Feed Science and Technology, 2006, 128: 276-291.

[5] Broudiscou L P, Lassalas B. Effects ofLavandulaofficinalisandEquisetumarvensedry extracts and isoquercitrin on the fermentation of diets varying in forage contents by rumen microorganisms in batch culture. Reproduction Nutrition Development, 2000, 40: 431-440.

[6] Soliva C R, Wimer S, Kreuaer M. Ruminal fermentation of mixed diets supplemented with St. John’s Wort (Hypericumperforatum) flowers and pine (Pinusmugo) oil or mixtures containing these preparations. Journal of Animal and Feed Sciences, 2008, 17: 352-362.

[7] Oskoueian E, Abdullah N, Oskoueian A. Effects of flavonoids on rumen fermentation activity, methane production, and microbial population. BioMed Research International, 2013, (6): 1-8.

[8] Myer P R, Kim M, Freetly H C,etal. Evaluation of 16S rRNA amplicon sequencing using two next-generation sequencing technologies for phylogenetic analysis of the rumen bacterial community in steers. Journal of Microbiological Methods, 2016, 127: 132-140.

[9] Zhang L Y. Feed Analysis and Detection Technology of Feed Quality[M]. 3rd edition. Beijing: China Agricultural University Press, 2007. 張麗英. 飼料分析及飼料質量檢測技術[M]. 第3版. 北京: 中國農業(yè)大學出版社, 2007.

[10] Yang F. Animal Nutrition[M]. 2nd edition. Beijing: China Agricultural University Press, 2010. 楊鳳. 動物營養(yǎng)學[M]. 第2版. 北京: 中國農業(yè)大學出版社, 2010.

[11] Wang J W, Wang L Z, Yan T H,etal. Diversity of ruminal and fecal microbiota of goat. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2015, 27(8): 2559-2571. 王繼文, 王立志, 閆天海, 等. 山羊瘤胃與糞便微生物多樣性. 動物營養(yǎng)學報, 2015, 27(8): 2559-2571.

[12] Highlaner S K. High throughput sequencing methods for microbiome profiling: application to food animal systems. Animal Health Research Reviews, 2012, 13(1): 40-53．

[13] Bahrin L G, Apostu M O, BIirsa L M,etal. The antibacterial properties of sulfur containing flavonoids. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2014, 24: 2315-2318.

[14] Tan H, Liu W. Bacteriostasis test on the flavonoid compounds fromEuphorbiahumifusaWilld.invitro. Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine, 2007, 4: 5-6. 譚紅, 劉偉. 地錦草總黃酮的體外抑菌試驗. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2007, 4: 5-6.

[15] Kim M, Morrison M, Yu Z. Status of the phylogenetic diversity census of ruminal microbiomes. FEMS Microbiology Ecology, 2011, 76(1): 49-63．

[16] Brulej M, Antonopoulos D A, Miller M E,etal. Gene-centric metagenomics of fiber-adherent bovine rumen microbiome reveals forage specific glycoside hydrolases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(6): 1948-1953.

[17] Singh K M, Ahir V B, Tripatili A K,etal. Metagenomic analysis of surti buffalo (Bubalusbubalis) rumen: a preliminary study. Molecular Biology Reports, 2012, 39(4): 4841-4848.

[18] JumasBilak E, Roudière L, Marchandin H. Description of ‘Synergistetes’ phyl. nov. and emended description of the phylum ‘Deferribacteres’ and of the family Syntrophomonadaceae, phylum ‘Firmicutes’. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology, 2009, 59(5): 1028-1035.

[19] Xing T, Mei L X, Li S. Research progress on relationship ofSynergistesand oral diseases. International Journal of Stomatology, 2009, 36(2): 177-179. 邢田, 梅陵宣, 李頌. 互養(yǎng)菌屬與口腔疾病關系的研究進展. 國際口腔醫(yī)學雜志, 2009, 36(2): 177-179.

[20] Xiao X R, Li Y, Xiao L Y. The novel species and genus discovered and nominated from the human oral cavity in 2009-2012. West China Journal of Stomatology, 2013, 31(2): 217-220. 肖曉蓉, 李燕, 肖麗英. 2009-2012年發(fā)現的人口腔細菌新種屬簡介. 華西口腔醫(yī)學雜志, 2013, 31(2): 217-220.

Effects of alfalfa flavonoids as dietary additives on bacterial flora in the rumen of dairy cows

ZHAN Jin-Shun1,2, WU Cai-Xia1, LIU Ming-Mei1,3, SU Xiao-Shuang1, ZHAN Kang1, ZHAO Guo-Qi1*

1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity，Yangzhou225009,China；2.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinary,JiangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanchang330200,China；3.JiangsuJointInstituteofTechnologyofProfessionofHuai’anBio-engineeringBranch,Huai’an223200,China

The objective of this study was to examine the effects of alfalfa flavonoids on the bacterial flora in the rumen of dairy cows. Four primiparous Holstein cows fitted with ruminal cannulas were used in a 4×4 Latin square design and were fed a total mixed ration containing 0, 20, 60, or 100 g alfalfa flavonoids per day (group A-D, respectively). The experiment had four periods and each period lasted 24 days. The ruminal fluid was collected during each period. Total bacterial DNA was extracted from the ruminal fluid, and 16S RNA sequences were obtained using the Illumina MiSeq platform. In total, 52747 operational taxonomic units (OTUs) were generated, and 16142 OTUs were shared by four groups, accounting for 30.60% of the total OTUs. The largest amount of OTUs was in group A. As the amount of alfalfa flavonoids in the diet increased, the Shannon index first increased and then decreased, but the abundance-based coverage estimator and Chao 1 indexes were unaffected. Simpson’s index was significantly higher for group C than for groups A and D (P<0.05). There were more bacterial genera in group C than in groups B and A, but the number of phyla in each group was not affected by the amount of alfalfa flavonoids in the diet. At the phylum level, the relative abundance of SR1 tended to increase linearly (0.05

alfalfa; flavonoids; microorganism; rumen; dairy cow

10.11686/cyxb2016358

2016-09-21；改回日期：2016-11-17

江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程項目(PAPD)，江蘇省農業(yè)三新工程項目(SXGC[2016]326)和江蘇省高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目(KYZZ_0367)資助。

占今舜(1985-)，男，江西玉山人，博士。E-mail:zhanjinshun1985@163.com

*通信作者Corresponding author. E-mail: gqzhao@yzu.edu.cn

http://cyxb.lzu.edu.cn

占今舜, 鄔彩霞, 劉明美, 蘇效雙, 詹康, 趙國琦. 飼糧添加苜蓿黃酮對奶牛瘤胃菌群的影響. 草業(yè)學報, 2017, 26(7): 82-89.

ZHAN Jin-Shun, WU Cai-Xia, LIU Ming-Mei, SU Xiao-Shuang, ZHAN Kang, ZHAO Guo-Qi. Effects of alfalfa flavonoids as dietary additives on bacterial flora in the rumen of dairy cows. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 82-89.