骨疏顆粒對骨質(zhì)疏松大鼠骨形成和骨吸收標(biāo)志物的影響

杜義斌　郭文清　嚴(yán)繼林

摘要：目的觀察骨疏顆粒對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝指標(biāo)的影響。方法選擇SD大鼠90只，空白對照組（假手術(shù)組）15只，手術(shù)造模組75只。造模組切除卵巢復(fù)制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒高、中、低劑量組5組，每組12只?？瞻讓φ战M、模型組給予生理鹽水10ml/（kg.d）灌胃；戊酸雌二醇組給予戊酸雌二醇片0.09mg/（kg.d）灌胃；骨疏顆粒高、中、低劑量組分別按照高劑量5.4 g/（kg.d），中劑量2.7 g/（kg.d），低劑量1.35 g/（kg.d）灌胃。連續(xù)灌胃12周。收集各組大鼠尿液、股動(dòng)脈血。檢測血ca、血P、尿ca、尿Cr、0c、ALP、TRAP、DPD及尿Ca/Cr。結(jié)果骨疏顆粒高劑量組血Ca濃度與戊酸雌二醇組無差異（P>0.05）；骨疏顆粒高中低劑量組0C均高于戊酸雌二醇組（P<0.05）；骨疏顆粒高劑量組ALP及TRACP與戊酸雌二醇組比較無差異（P>0.05）；骨疏顆粒高中低劑量組DPD均低于戊酸雌二醇組（P<0.05），骨疏顆粒高劑量組與戊酸雌二醇組Ca/Cr無差異（P>0.05）。結(jié)論骨疏顆粒與戊酸雌二醇均能降低骨吸收標(biāo)志物，增加骨形成標(biāo)志物，改善絕經(jīng)后大鼠骨質(zhì)疏松相關(guān)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：骨質(zhì)疏松；骨疏顆粒；骨形成標(biāo)志物；骨吸收標(biāo)志物；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2017）03-0068-04

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（Postmenopausal osteoporosis，PMPO）常見和多發(fā)于絕經(jīng)后婦女，雌激素缺乏是主要病因。隨著我國人口老齡化不斷加劇，由骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致老年人發(fā)生骨折和（或）致殘的住院率不斷上升，這已成為棘手的公共衛(wèi)生問題。骨疏顆粒是本院治療骨質(zhì)疏松癥的科研觀察用藥，前期試驗(yàn)研究顯示，該方能改善骨質(zhì)疏松癥相關(guān)癥狀，提高腰椎骨密度水平。為進(jìn)一步揭示骨疏顆粒的抗骨質(zhì)疏松機(jī)制，筆者開展了該項(xiàng)研究，探討骨疏顆粒對骨形成、骨吸收等骨代謝相關(guān)指標(biāo)的影響。

1資料與方法

1.1造模與分組 清潔級健康雌性未孕SD大鼠90只，3月齡，體重（250±20）g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，合格證號(hào)：SCXK（滇）2015-0002。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度20-25℃，濕度40%-50%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取大鼠15只作為假手術(shù)組，余75只作為手術(shù)造模組。手術(shù)造模組通過手術(shù)切除雙側(cè)卵巢的方法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型，假手術(shù)組不切除卵巢僅切除卵巢周圍少量脂肪組織。術(shù)后12周，手術(shù)造模組與假手術(shù)組各隨機(jī)抽取2只大鼠，取其左后肢股骨進(jìn)行病理組織切片確定造模成功。將手術(shù)造模組存活的60只大鼠隨機(jī)分為模型組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒高劑量組、骨疏顆粒中劑量組、骨疏顆粒低劑量組5組，每組12只；假手術(shù)組作為空白對照組。分別進(jìn)行相應(yīng)藥物干預(yù)，空白對照組、模型組給予生理鹽水10ml/（kg.d）灌胃，持續(xù)12周；戊酸雌二醇組給予戊酸雌二醇片0.09mg/（k昏d）灌胃，持續(xù)12周；骨疏顆粒高、中、低劑量組分別按照高劑量5.4 g/（kg.d），中劑量2.7 g/（kg.d），低劑量1.35 g/（k昏d）灌胃，持續(xù)12周。實(shí)驗(yàn)全程普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。相應(yīng)藥物干預(yù)12周后，在處死前將大鼠置于代謝籠內(nèi)收集尿液，離心后冰凍保存待檢；接下來處死全部實(shí)驗(yàn)大鼠，股動(dòng)脈取血，離心后冰凍保存待檢。

1.2藥品與試劑

1.2.1藥品 骨疏顆粒：云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，由狗脊、黃芪、白術(shù)、三七、獨(dú)活等藥組成，10g/袋；戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂）：拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，1 mg×21片/盒。生產(chǎn)企業(yè)：DELPHARM lille S.A S；進(jìn)口藥品注冊證號(hào)：H20120368；藥品批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字J20130009。

1.2.2試劑 生化指標(biāo)試劑盒（武漢優(yōu)爾生生物科技股份有限公司生產(chǎn)）；骨代謝標(biāo)志物：骨形成標(biāo)志物血清骨鈣素（OC）（批號(hào)201603029）、血清堿性磷酸酶（ALP）（批號(hào)P0321），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）（批號(hào)P0332）、尿脫氧吡啶啉（DPD）（批號(hào)P0341）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1造模 應(yīng)用Saville手術(shù)切除雌性大鼠雙側(cè)卵巢的方法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型，假手術(shù)組不切除卵巢。喂養(yǎng)12周后，假手術(shù)組、手術(shù)造模組各隨機(jī)抽取2只大鼠取左后肢股骨行病理切片確定造模成功與否。

1.3.2給藥方法 造模成功后，將手術(shù)造模組60只大鼠隨機(jī)分為模型對照組、戊酸雌二醇組、骨疏顆粒高劑量組、骨疏顆粒中劑量組、骨疏顆粒低劑量組5組，每組12只；假手術(shù)組作為空白對照組，分別進(jìn)行不同藥物干預(yù)?？瞻讓φ战M、模型對照組給予生理鹽水10 mL/（kg.d）灌胃，持續(xù)12周；戊酸雌二醇組給予戊酸雌二醇片0.09 mg/（kg.d）灌胃，持續(xù)12周；骨疏顆粒高、中、低劑量組分別按照高劑量5.4 g/（kg.d），中劑量2.7 g/（kg.d），低劑量1.35 g/（kg.d）灌胃，持續(xù)12周。實(shí)驗(yàn)全程普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.3.3觀察指標(biāo)及檢測方法 （1）血Ca、血P、尿Ca、尿Cr使生化法進(jìn)行檢測；（2）OC、ALP、TRAP、DPD檢測，使用ELISA法檢測；（3）大鼠左后肢股骨骨病理檢測骨小梁數(shù)、骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁分離度、骨小梁厚度。骨標(biāo)本取材及制備：用3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后股動(dòng)脈徹底抽血處死，分離股骨，去除肌肉，將骨樣本置于10%磷酸鹽緩沖液配制的甲醛溶液中固定24 h，再經(jīng)70%乙醇脫水后，用特殊骨染料染色5天。以后用50%乙醇開始逐級脫水及丙酮脫脂，最后用甲丙烯酸甲酯包埋不脫鈣骨，包埋塊干后鋸成300 mm骨片，經(jīng)磨成20 mm的薄片再次梯度脫水，透明封固。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。多組間比較根據(jù)資料的性質(zhì)不同，分別選用One-Way ANO-VA和Kruskal-Wallis Test的比較方法。單因素方差分析用于完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的多個(gè)樣本均數(shù)間的比較，其統(tǒng)計(jì)推斷是推斷各樣本所代表的各總體均數(shù)是否相等。方差分析的兩個(gè)基本假設(shè)：1）各樣本是相互獨(dú)立的隨機(jī)樣本，均服從正態(tài)分布；2）各樣本的總體方差相等，即方差齊性（homogeneityofvari-ance）。若不能滿足以上兩個(gè)條件，采用Kruskal-Wallis Test非參數(shù)方法。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1大鼠存活情況 假手術(shù)組大鼠，手術(shù)中及術(shù)后死亡2只，造模組大鼠手術(shù)手術(shù)中及術(shù)后死亡15只。灌胃操作致使大鼠死亡7只。試驗(yàn)后期空白對照組大鼠精神狀況良好，被毛光澤；模型組大鼠蜷縮嗜睡，活動(dòng)較少，被毛無光澤且有脫落；戊酸雌二醇組與骨疏顆粒不同劑量組大鼠活動(dòng)尚可，精神狀況良好。

2.2造模成功的判定 觀察統(tǒng)計(jì)2組大鼠左后肢股骨骨組織病理片骨小梁數(shù)、骨小梁面積百分、骨小梁分離度、骨小梁厚度數(shù)據(jù)比較見表1。

表-1可知，骨小梁數(shù)、骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁分離度、骨小梁厚度4項(xiàng)指標(biāo)假手術(shù)組與手術(shù)造模組間之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），假手術(shù)組的骨小粱數(shù)、骨小梁面積百分比、骨小梁厚度均高于手術(shù)造模組，假手術(shù)組骨小梁分離度低于手術(shù)造模組。兩組間比較：手術(shù)造模組出現(xiàn)嚴(yán)重骨質(zhì)疏松，說明造模成功。

2.3各組大鼠血清礦物質(zhì)水平比較 見表2。

表2可知，與空白對照組比較，模型組血鈣明顯高于空白對照組（P<0.01），與模型組比較，骨疏顆粒高劑量組和戊酸雌二醇組血鈣濃度明顯低于模型組（P<0.01），與戊酸雌二醇組比較，骨疏顆粒高劑量組血鈣濃度與之無差異（P>0.05）。

2.4各組大鼠骨形成標(biāo)志物水平比較 見表3。

表3可知，模型組OC明顯高于空白對照組（P<0.01），骨疏顆粒高劑量組和戊酸雌二醇組OC低于模型組（P<0.05），骨疏顆粒高劑量組OC高于戊酸雌二醇組（P<0.05）；骨疏顆粒高劑量組OC低于中、低劑量組（P<0.05）；模型組ALP明顯高于空白對照組（P<0.01）；骨疏顆粒高劑量組和戊酸雌二醇組ALP明顯低于模型組（P<0.01），骨疏顆粒高劑量組ALP濃度與戊酸雌二醇組無差異（P>0.05）；骨疏顆粒高劑量組ALP濃度低于中、低劑量組（P<0.05）。

2.5各組大鼠骨吸收標(biāo)志物水平比較 見表4。

表4可知，模型組TRACP明顯高于空白對照組（P<0.01），戊酸雌二醇組和骨疏顆粒高劑量組TRACP均明顯低于模型組（P<0.01），骨疏顆粒高劑量組與戊酸雌二醇組組間無差異（P>0.05），骨疏顆粒高劑量組TRACP濃度低于低、中劑量組（P<0.05）；模型組DPD明顯高于空白對照組（P<0.01）；戊酸雌二醇組和骨疏顆粒不同劑量組DPD均低于模型組（P<0.01），骨疏顆粒不同劑量組與戊酸雌二醇組均能降低DPD水平，戊酸雌二醇優(yōu)于骨疏顆粒不同劑量組，骨疏顆粒高劑量組DPD濃度低于低、中劑量組（P<0.05）；模型組Ca/Cr明顯高于空白對照組（P<0.01）；戊酸雌二醇組和骨疏顆粒高劑量組Ca/Cr水平明顯低于模型組（P<0.01），骨疏顆粒高劑量組與戊酸雌二醇組組間無差異（P>0.05），高劑量組降低Ca/Cr水平優(yōu)于低、中劑量組（P<0.05）。

3討論

PMOP的發(fā)生是由于婦女在絕經(jīng)后卵巢功能逐漸衰退，體內(nèi)雌激素水平下降，以進(jìn)行性骨丟失、骨小梁退行性改變、骨脆性增加及易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨疾病。體內(nèi)雌激素的缺乏是導(dǎo)致PMOP發(fā)生的主要原因。20世紀(jì)80年代Gray等首先在體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了ER的存在，雌激素主要通過雌激素受體（ER）來發(fā)揮效應(yīng)。人體的骨代謝是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程，主要由破骨細(xì)胞的骨吸收和成骨細(xì)胞的骨形成調(diào)控。張健等認(rèn)為雌激素對骨代謝的調(diào)節(jié)作用主要通過阻止骨吸收來抑制因絕經(jīng)引起的骨重建高轉(zhuǎn)換狀態(tài)，達(dá)到防治骨丟失、維持骨量的目的。雌激素缺乏還引起的骨吸收亢進(jìn)，主要是破骨細(xì)胞產(chǎn)生過多和靜息態(tài)的破骨細(xì)胞被激活后活性增強(qiáng)。研究表明當(dāng)雌激素缺乏時(shí)，其促進(jìn)骨形成的作用效能降低，出現(xiàn)骨形成障礙。在骨代謝過程中會(huì)產(chǎn)生一些標(biāo)志物，這些標(biāo)志物水平的高低可以評估骨代謝狀況，骨形成標(biāo)志物有ALP、OC等，骨吸收標(biāo)志物包括TRACP、DPD、Ca/Cr等。人體在正常情況下血鈣、血磷的濃度呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)骨質(zhì)疏松病情較為嚴(yán)重時(shí)，骨吸收較明顯，血鈣的濃度會(huì)升高，而血磷的濃度則下降。本實(shí)驗(yàn)表明，使用骨疏顆粒與戊酸雌二醇治療后血磷水平上升、血鈣水平下降，推測上述2藥能抑制骨吸收，減少骨鈣流向血液；ALP水平與成骨細(xì)胞和前成骨細(xì)胞活性呈線性關(guān)系，具有較高的骨組織特異性，被認(rèn)為是骨形成標(biāo)志物。OC是一種由成骨細(xì)胞分泌的反映骨轉(zhuǎn)換率的血清檢測物。本實(shí)驗(yàn)顯示，骨疏顆粒和戊酸雌二醇均降低ALP、OC，說明兩藥能有效促進(jìn)骨形成；在骨吸收過程中破骨細(xì)胞能向血中釋放TRACP，其活性與骨吸收強(qiáng)度相平行。DPD僅存于骨的I型膠原纖維中，當(dāng)破骨細(xì)胞活動(dòng)時(shí)從尿中排出，它的實(shí)驗(yàn)室檢測不受飲食影響。尿鈣/尿肌酐（Ca/Cr）比值也是反映骨吸收的廉價(jià)的指標(biāo)，能夠反映骨吸收水平。本實(shí)驗(yàn)表明2藥均能降TRACP、DPD、Ca/Cr，推測兩藥能減弱骨吸收強(qiáng)度。

總之，本實(shí)驗(yàn)表明骨疏顆粒和戊酸雌二醇均能對骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝標(biāo)志物產(chǎn)生影響，具體表現(xiàn)為降低骨形成標(biāo)志物，增加骨吸收標(biāo)志物，其作用強(qiáng)度與骨疏顆粒的藥物濃度有正相關(guān)趨勢。結(jié)合既往的實(shí)驗(yàn)研究推測，骨疏顆粒與雌激素有相似的作用機(jī)制，都是通過調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性發(fā)揮發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的。

（收稿日期：2016-12-20）