復(fù)方君子湯誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

陳毅寧　梁春靈　廖斌　皇甫真萍　齊彥　陳佳薇

摘要：目的本研究探討復(fù)方君子湯（FFJZ）對抑制白血病K562細(xì)胞生長增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制。方法 用不同濃度復(fù)方君子湯作用于K562細(xì)胞，應(yīng)用MTF法觀察復(fù)方君子湯對K562細(xì)胞生長增殖的影響，AnnexinV/PT染色和流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞凋亡，Western blot檢測Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達(dá)。結(jié)果在一定濃度的復(fù)方君子湯作用后的K562細(xì)胞的增殖被抑制，隨著濃度的增加及使用時(shí)間的延長，K562細(xì)胞的增殖抑制率及凋亡比例明顯增加；同時(shí)，Caspase-8蛋白及FaS蛋白的表達(dá)明顯上升。結(jié)論一定濃度的復(fù)方君子湯可抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：復(fù)方君子湯；白血?。籏562細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；機(jī)制

中圖分類號：R289.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2017）03-0018-04

白血病是一種常見的惡性血液系統(tǒng)腫瘤，嚴(yán)重危害人類生命健康，細(xì)胞分化與凋亡受阻是白血病發(fā)病的重要機(jī)制之一，因此探索誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的新藥是目前研究白血病治療的熱點(diǎn)之一。中醫(yī)認(rèn)為白血病的發(fā)病是由于機(jī)體正氣虧虛，邪毒傷髓，毒瘀互結(jié)，繼而發(fā)病，治療上當(dāng)遵循益氣養(yǎng)陰、扶正祛邪與活血化瘀三法并用之原則，復(fù)方君子湯是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院經(jīng)過臨床實(shí)踐總結(jié)而成，在急性白血病的臨床治療中取得良好療效。為進(jìn)一步研究復(fù)方君子湯抗白血病的生物學(xué)作用，筆者觀察了復(fù)方君子湯對人白血病細(xì)胞K562生長的影響，并對其相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行了探討?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1主要試劑 復(fù)方君子湯（黨參20 g，黃芪20 g，茯苓15 g，白術(shù)15 g，川芎10 g，浙貝母10 g，補(bǔ)骨脂10 g，甘草6 g等）由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院中藥制劑室提供。四甲基偶氮唑藍(lán)（mehyl-thazol-tetrazolinum，MTF）購自Serva公司；胎牛血清（bovine scrtlln albumin，BSA）購自杭州四季青生物公司；臺盼藍(lán)購自Chroma公司；改良型PRMI-1640培養(yǎng)基為海克隆生物化學(xué)制品公司產(chǎn)品；二甲亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）購自北京化工廠；AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞來源 人紅白血病細(xì)胞株K562由河南省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3主要儀器 倒置相差顯微鏡（IX71型）為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；水套式c02培養(yǎng)箱（CJ-1100型）為長沙長棉應(yīng)用技術(shù)研究所產(chǎn)品；立式滅菌器（LMQ·C型）為山東新華醫(yī)療器械公司生產(chǎn)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9143BS-Ⅲ型）為上海新苗醫(yī)療器械公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀（Model680型）為BIORAD公司生產(chǎn)；凈化工作臺（SW-CJ-1F型）為蘇凈集團(tuán)公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀（Coulter EPICS型）為Beckman Coulter公司產(chǎn)品；高速低溫離心機(jī)（Allegra TMX一12R型）為Beckman公司產(chǎn)品。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞使用含10%小牛血清、鏈霉素及青霉素各100U/ml的nyQ改良型PRMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于濃度為5%，溫度為37℃、濕度為100%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天換液1次，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5MTF法測定細(xì)胞增殖抑制率 選取對數(shù)生長期K562細(xì)胞按2.0×10⁵/ml密度分別接種于96孔培養(yǎng)板，隨機(jī)分為五組，分別為：①空白對照組；②As：03組：加入AS₂O₃（終濃度為3×10^-6mol/L）；③復(fù)方君子湯組：加復(fù)方君子湯（終濃度分別為2.0、6.0、10.0mg/mL），每組設(shè)8個(gè)平行復(fù)孔，置于CO₂培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)，分別于24 h，48 h.72 h取各組培養(yǎng)板，每孔加入20μlMTF（5.0，.g/mE），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后棄上清液，加入100ulDMSO，搖勻并震蕩10min，在酶標(biāo)儀上讀取450 nm處測吸光值。計(jì)算K562細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組平均吸光度/細(xì)胞對照組平均吸光度）]×100%。

1.6AnnexinV/PI雙染色法和流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞凋亡 分別收集各組培養(yǎng)24 h，48 h，72 h后的細(xì)胞，并將其濃度調(diào)整為5.0×10⁵/mL。將細(xì)胞重懸浮于100μL結(jié)合緩沖液（10mmol/L HEPES，pH 7.4，140 nunol/L NaOH，2.5 mmnol/LCaCl₂）。加入10 uL AnnexinV和5 uL PI，輕輕混勻，4℃避光反應(yīng)30分鐘。再加入100μl結(jié)合緩沖液，在1小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測熒光強(qiáng)度，重復(fù)3次。

1.7Westem blot檢測Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達(dá) 收集經(jīng)10.0mg/L的復(fù)方君子湯處理后的K562細(xì)胞2.0×10⁵/ml，經(jīng)離心、PBS緩沖液洗滌，同時(shí)設(shè)立不加藥物的空白對照組，用1 xNuPAGE LDS細(xì)胞裂解液（含50mmol/L二硫蘇糖醇，DTF）裂解細(xì)胞后，采用考馬斯亮藍(lán)法（Coomassie Assay）測定總細(xì)胞提取液中的蛋白濃度。取30μg經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，5%無脂牛奶封閉2h，加一抗在4℃過夜孵育，TBS緩沖液洗滌3次，二抗室溫孵育2h，化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組均數(shù)之間比較采用t檢驗(yàn)；組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MTF法測定不同濃度組的細(xì)胞增殖抑制率 2.0、6.0、10.0 mg/ml的復(fù)方君子湯分別作用于K562細(xì)胞24 h、48 h、72h后的細(xì)胞生長抑制率（表1，圖1）。檢測結(jié)果顯示，2.0 mg/ml的復(fù)方君子湯組與空白對照組無顯著差別（P>0.05），其余各濃度組K562細(xì)胞的抑制率與藥物濃度及使用時(shí)間呈正相關(guān)（r=0.699），各濃度組與空白對照組相比有顯著差異（P<0.01）。

2.2AnnexinV/PI檢測不同濃度組的細(xì)胞凋亡率 隨作用濃度的增加凋亡率也逐漸增高，2.0 mg/L的復(fù)方君子湯對K562細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用不明顯，與空白對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），而6.0mg/L的復(fù)方君子湯使K562細(xì)胞早期凋亡比例明顯增高，與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），而濃度達(dá)到10.0 mg/L時(shí)，細(xì)胞晚期凋亡比例明顯增多，與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）（表2）。

2.3Western blot檢測Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達(dá)

Western blot分析結(jié)果表明，6.0mg/L及10.0mg/L的復(fù)方君子湯作用72h后Caspase-8蛋白及Fas蛋白表達(dá)水平明顯升高，和空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表3。

3討論

復(fù)方君子湯是本科在臨床實(shí)踐中不斷摸索總結(jié)而成的經(jīng)驗(yàn)方，在臨床運(yùn)用中取得良好療效。我科前期實(shí)驗(yàn)研究表明復(fù)方君子湯對惡性腫瘤化療有明顯增效減毒作用，能明顯逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞株K562/VCR耐藥性，提高耐藥細(xì)胞對阿霉素的敏感性。本研究通過對復(fù)方君子湯對白血病細(xì)胞K562誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究，以探討復(fù)方君子湯誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用特點(diǎn)，并進(jìn)一步探討死亡受體信號通路在復(fù)方君子湯誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用，更深入的了解復(fù)方君子湯抑制腫瘤的機(jī)理，從而為復(fù)方君子湯的臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，低劑量的復(fù)方君子湯（2.0mg/L）對K562的凋亡基本不起作用，而隨著濃度的升高，6.0mg/L及10.0mg/L的復(fù)方君子湯對K562細(xì)胞的抑制率及凋亡比例與空白對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），且與藥物濃度及使用時(shí)間呈正相關(guān)，其中6.0mg/L的復(fù)方君子湯組中I（562細(xì)胞早期凋亡比例明顯增高，而10.0mg/L的復(fù)方君子湯組中則以晚期凋亡為主。白血病K562細(xì)胞經(jīng)一定濃度的復(fù)方君子湯作用后caspase-8及Fas蛋白表達(dá)水平明顯升高，與空白對照組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），說明復(fù)方君子湯可能是通過上調(diào)Fas蛋白及caspase-8蛋白的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡。

隨著分子生物學(xué)的突飛猛進(jìn)，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，從中醫(yī)藥寶藏中挖掘分子靶向白血病治療藥物具有廣闊的前景。近幾年來中藥有效成分誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的研究取得重大突破，特別是靶向凋亡通路相關(guān)蛋白或酶的表達(dá)或功能調(diào)控的研究成為其中的熱點(diǎn)。如青蒿琥酯可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，且具有時(shí)間一效應(yīng)關(guān)系，同時(shí)上調(diào)K562細(xì)胞Fas蛋白的表達(dá)，下調(diào)FasL的表達(dá)，F(xiàn)as/FasL表達(dá)的改變可能是青蒿琥酯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。葛根總黃酮提取物及葛根素、大豆苷元單體均能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，且可能是Fas死亡受體和/或線粒體途徑所介導(dǎo)。姜黃素可誘導(dǎo)髓系白血病細(xì)胞凋亡，引起Fas水平增高，同時(shí)Caspase-8和Caspase-9都顯著增高，故推斷其可能通過死亡受體途徑和線粒體途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些報(bào)道表明Fas/FasL通路的激活可能是不同抗腫瘤中藥活性成分誘導(dǎo)凋亡的共同分子途徑。Fas的凋亡信號主要是通過與其胞漿區(qū)相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白FADD介導(dǎo)的，當(dāng)Fas與FasL結(jié)合后，活化細(xì)胞死亡蛋白酶caspase-8，使其活化成具有酶活性的蛋白酶，隨之活化連鎖鏈，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)表明復(fù)方君子湯對白血病K562細(xì)胞有明顯的抑制生長增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，且與上調(diào)Fas蛋白及easpase-8蛋白表達(dá)有關(guān)，因此，我們推測復(fù)方君子湯對白血病K562細(xì)胞的凋亡機(jī)制可能與Fas-FADD-caspase-8軸有著密切關(guān)系，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究探索。

綜上，通過初步研究證實(shí)了一定濃度的復(fù)方君子湯在體外可抑制白血病K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其可能與上調(diào)Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達(dá)有密切的關(guān)系。但復(fù)方君子湯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可能非常復(fù)雜，值得進(jìn)一步深入研究。

（收稿日期：2016-11-28）