“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”的教學(xué)與思考

房克鳳

摘要 “熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”是基于北京農(nóng)學(xué)院現(xiàn)有研究生課程的基礎(chǔ)上面擬向農(nóng)業(yè)生產(chǎn)類、生物專業(yè)、動(dòng)物專業(yè)以及園林專業(yè)的碩士研究生設(shè)置的選修課，其目的在于為研究生進(jìn)行正式學(xué)術(shù)研究打下一定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)。主要講述體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡的原理及應(yīng)用。根據(jù)學(xué)校新修改的研究生課程設(shè)置的精神，進(jìn)行精講多練。總27學(xué)時(shí)，其中7學(xué)時(shí)理論，20學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)。通過本課程的開設(shè)，使得研究生能夠掌握體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡以及激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和使用，為科研工作的順利進(jìn)行打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 熒光顯微術(shù) 課程 教學(xué) 思考

中圖分類號(hào)：G424 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2017.05.074

“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”是一門非常重視實(shí)踐性的技術(shù)基礎(chǔ)課?！盁晒怙@微術(shù)原理及應(yīng)用”是基于北京農(nóng)學(xué)院現(xiàn)有研究生課程的基礎(chǔ)上擬向農(nóng)業(yè)生產(chǎn)類、生物專業(yè)、動(dòng)物專業(yè)以及園林專業(yè)的一年級(jí)碩士研究生開設(shè)的公共選修課，希望通過該課程的開設(shè)，為研究生開展學(xué)術(shù)研究奠定一定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)。該課程對(duì)于研究生掌握科學(xué)研究中的細(xì)胞生物學(xué)觀察方法，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立進(jìn)行科學(xué)研究的素養(yǎng)和能力具有重要作用。作為新開研究生課程，基于北京農(nóng)學(xué)院的實(shí)際情況對(duì)“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”的教學(xué)與實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了如下設(shè)置及思考。

1“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”課程開設(shè)的必要性

1.1研究手段和技術(shù)的發(fā)展的需要

物質(zhì)吸收電磁輻射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，而受到激發(fā)的原子或分子在去激發(fā)過程中再發(fā)射波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，這種再發(fā)射的光稱為熒光。生物體內(nèi)有些物質(zhì)有自發(fā)熒光，如葉綠素或細(xì)胞壁的某些成分，受紫外線照射后發(fā)出熒光；生物體內(nèi)大部分物質(zhì)本身不能發(fā)出熒光，但如果用特異性的熒光染料標(biāo)記后，經(jīng)紫外線或其他波長(zhǎng)的光照射后也可以發(fā)出熒光，這種熒光可以被熒光顯微鏡捕獲，并進(jìn)行定量分析。因此，熒光顯微術(shù)就是基于熒光對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行研究的技術(shù)。熒光顯微鏡依據(jù)觀察物體大小及原理又可以分為多種。常用的有體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡等等。

體視熒光顯微鏡能對(duì)微小樣品進(jìn)行快速、清晰的顯微觀察，并實(shí)現(xiàn)完全無漂移的三維立體成像，配有較長(zhǎng)的工作距離，不僅能夠獲得較大的景深和光學(xué)細(xì)節(jié)，還能保證樣品的真實(shí)色彩；對(duì)樣品能進(jìn)行實(shí)體測(cè)量；具有良好的操控系統(tǒng)，可提供優(yōu)良的重復(fù)性從而使實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)化。但是體式熒光顯微鏡有缺陷性。其放大倍率較低，適合于研究對(duì)象的整體觀察和活體觀察以及一些較大的器官和組織的觀察，不適合觀察小組織或細(xì)胞。

與體式熒光顯微鏡相比，熒光顯微鏡放大倍數(shù)較高，工作距離較短?？梢杂^察更多的細(xì)節(jié)。能在組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞的水平上研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的定位、營(yíng)養(yǎng)成分的吸收、運(yùn)輸，以及化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。可以進(jìn)行活體或固定材料的觀察。

激光掃描共聚焦顯微鏡是上個(gè)世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種非常精密的儀器設(shè)備。它以光學(xué)為基礎(chǔ)，將機(jī)械、電子、計(jì)算機(jī)等融為一體。與體式熒光顯微鏡和熒光顯微鏡不同，激光共聚焦以激光為光源，可以把標(biāo)本分成多個(gè)光學(xué)斷層，逐層進(jìn)行掃描并成像，因此是一種新顯微層面的研究手段。此外，由于激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞和組織連續(xù)光學(xué)切片無損傷，而且能夠?qū)铙w細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)觀察，使它在生物科學(xué)的研究中占有獨(dú)特的地位。目前，人們已廣泛應(yīng)用該技術(shù)來觀察和分析細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)和分子在細(xì)胞內(nèi)的分布，例如細(xì)胞內(nèi)游離鈣、活性氧、轉(zhuǎn)錄因子、表面分子、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞膜流動(dòng)性、胞內(nèi)分子的運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞間的縫隙連接、蛋白問的相互作用等方面。

傳統(tǒng)的熒光顯微鏡配備的是膠卷相機(jī)，膠卷的沖洗非常復(fù)雜、耗時(shí)耗力。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字成像系統(tǒng)也應(yīng)用到熒光顯微術(shù)上。其中電荷耦合元件（Charge-coupled Device，CCD）就是與熒光顯微鏡密切相關(guān)的數(shù)碼攝像產(chǎn)品。它能夠?qū)晒怙@微鏡拍攝的顯微攝影產(chǎn)品通過USB接口傳輸?shù)诫娔X中，便于圖像的采集研究。隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，分辨率也越來越高，因此通過CCD，可以拍攝到分辨率更高的圖片。

1.2課程設(shè)置的需要

根據(jù)本校研究生現(xiàn)有課程以及科研工作的需要，特開設(shè)“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”?，F(xiàn)有的課程“植物顯微技術(shù)”注重石蠟切片，尤其是實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)甚少涉及顯微鏡；而現(xiàn)有的“電子顯微鏡”課程主要講述超薄切片和透射電鏡以及掃描電鏡的原理及使用。因而“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”課程的開設(shè)，填補(bǔ)了兩者之間的空檔，能夠更好地為廣大教師和研究生的科學(xué)研究工作服務(wù)。

1.3科學(xué)研究的需要

隨著學(xué)校教師科研項(xiàng)目的增多、科學(xué)研究的深入，越來越需要使用相應(yīng)的技術(shù)手段，例如研究特定基因功能，需要進(jìn)行轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，一般加入GFP，YFP等報(bào)告基因，此時(shí)需在激光掃描共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察將基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行定位并分析。

1.4現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的支持

北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室下設(shè)三個(gè)研究平臺(tái)，其中顯微平臺(tái)具備體式熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、正置熒光顯微鏡和Leiea的激光掃描共聚焦掃描顯微鏡等大型儀器設(shè)備，為本課程的順利開設(shè)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.5教輔人員的配備

開設(shè)本課程的教師具有多年教學(xué)經(jīng)驗(yàn)以及多年管理體式熒光顯微鏡、正置熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡等設(shè)備的經(jīng)驗(yàn)，為本課程的順利開設(shè)奠定了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

2安排合理的教學(xué)和實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1理論與實(shí)踐相結(jié)合的教學(xué)理念

熒光顯微術(shù)具有非常強(qiáng)的技術(shù)性和應(yīng)用性，但理論知識(shí)的學(xué)習(xí)也是必不可少的。掌握了理論知識(shí)，能夠促進(jìn)實(shí)踐應(yīng)用。利用熒光進(jìn)行顯微觀察的顯微鏡有許多種，根據(jù)本校的設(shè)備基礎(chǔ)結(jié)合教師們的研究需求，重點(diǎn)選擇體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡等內(nèi)容。首先，要進(jìn)行相關(guān)的理論講解，使研究生們掌握理論基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一些獨(dú)立、完整的小實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生能夠掌握相應(yīng)儀器的使用方法。例如利用體式熒光顯微鏡進(jìn)行轉(zhuǎn)基因材料的鑒定。體式熒光顯微鏡具有較大的景深，能夠非常方便地觀察轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因材料，如草莓、番茄、板栗、海棠、百合、玉米等。大大簡(jiǎn)化了原來在顯微鏡下觀察的繁瑣的前處理過程。

2.2選擇合適的教學(xué)內(nèi)容

根據(jù)研究生的研究需求結(jié)合學(xué)術(shù)發(fā)展的進(jìn)展，選擇合適的教學(xué)內(nèi)容。理論課程內(nèi)容主要分為五個(gè)部分。第一部分顯微鏡的發(fā)展簡(jiǎn)史。包括顯微鏡的發(fā)展，熒光的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展、選擇及使用、熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展和使用等等。第二部分為體式熒光顯微鏡，包括其理論及應(yīng)用。第三部分為熒光顯微鏡，包括理論及應(yīng)用。第四部分為激光掃描共聚焦顯微鏡的理論和應(yīng)用。第五部分：其他熒光顯微技術(shù)，如更為先進(jìn)的雙光子熒光顯微鏡、轉(zhuǎn)盤激光掃描共聚焦顯微鏡等內(nèi)容。

2.3設(shè)置合理的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

教學(xué)中想盡辦法引導(dǎo)學(xué)生把理論知識(shí)和其自身的科學(xué)研究有機(jī)結(jié)合，提高學(xué)生的興趣和對(duì)知識(shí)的掌握能力?；诒拘＾r(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室顯微平臺(tái)的儀器設(shè)備配置情況，結(jié)合研究生研究課題的需求，設(shè)置相應(yīng)的較為系統(tǒng)性的小實(shí)驗(yàn)。

體式熒光顯微鏡因其景深較大，可以觀察較大的實(shí)驗(yàn)材料。例如可以觀察本校不同研究團(tuán)隊(duì)的轉(zhuǎn)基因材料以及較大的組織塊等。前期已經(jīng)成功觀察到了根的轉(zhuǎn)基因熒光。

熒光顯微鏡觀察花粉管內(nèi)囊泡運(yùn)輸。首先需要選擇合適的花粉。不同物種的花粉其萌發(fā)時(shí)間及生長(zhǎng)速度差異巨大，要選擇生長(zhǎng)速度合適的花粉。首先要培養(yǎng)花粉管，其次用熒光染料FM 4-64標(biāo)記囊泡，在此過程中需要學(xué)生分組合作，配置所需試劑，隨后在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)情況。接著選擇合適的花粉管，用熒光染料FM 4-64標(biāo)記囊泡，隨后在熒光顯微鏡下觀察囊泡運(yùn)輸情況并采集圖像，利用軟件對(duì)熒光進(jìn)行定量分析，得出相應(yīng)結(jié)論，撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

利用激光共聚焦顯微鏡采集花粉管內(nèi)游離鈣離子信號(hào)。植物細(xì)胞因具細(xì)胞壁，鈣離子標(biāo)記較為復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，能夠鍛煉研究生的動(dòng)手能力?；ǚ酃芘囵B(yǎng)完畢后用Fluo 4 AM標(biāo)記鈣離子，用xyt的模式觀察鈣離子的動(dòng)態(tài)變化，利用軟件進(jìn)行熒光定量分析，得出相應(yīng)結(jié)論，撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

3考核方式的探索

根據(jù)本門課程注重實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)，以及出于對(duì)學(xué)生基本實(shí)驗(yàn)技能、創(chuàng)新意識(shí)、創(chuàng)造性思維、科學(xué)思想、科學(xué)態(tài)度等進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，總成績(jī)?cè)u(píng)定由三部分組成：（1）上課及參加實(shí)驗(yàn)的考勤（占30%）；（2）自己制作并進(jìn)行顯微觀察的圖片質(zhì)量（占40%）；（3）實(shí)驗(yàn)報(bào)告寫作及其對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)問題的分析情況（占30%）。課程論文內(nèi)附有學(xué)生自己拍攝的自己制作的切片的顯微照片，以及對(duì)照片出現(xiàn)的問題分析。

4結(jié)語

“熒光顯微術(shù)原理及應(yīng)用”課程的特點(diǎn)是具有非常強(qiáng)的實(shí)踐性，對(duì)學(xué)生的科學(xué)態(tài)度、動(dòng)手能力及分析問題和解決問題的能力要求較高。因此，為了讓學(xué)生在較短的時(shí)間內(nèi)接受嚴(yán)格的正規(guī)訓(xùn)練，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程讓學(xué)生獨(dú)立操作，最后獲取圖片后，對(duì)樣品內(nèi)容、樣品質(zhì)量和圖片質(zhì)量進(jìn)行綜合分析，最后完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，能夠較大地提高了研究生進(jìn)行科學(xué)研究的綜合能力。