JMJD1A通過調(diào)節(jié)c-Myc的表達(dá)影響胃癌細(xì)胞的增殖及侵襲

王朝陽(yáng)，李炳輝，鄭忠立，孟繼明，任學(xué)群,3

1. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 普外科，河南 開封 475000； 2. 河南大學(xué) 循證醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000； 3. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000

JMJD1A通過調(diào)節(jié)c-Myc的表達(dá)影響胃癌細(xì)胞的增殖及侵襲

王朝陽(yáng)1,2，李炳輝1，鄭忠立1，孟繼明1，任學(xué)群1,2,3

1. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 普外科，河南 開封 475000； 2. 河南大學(xué) 循證醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000； 3. 河南大學(xué)淮河醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，河南 開封 475000

〔目的〕探討JMJD1A調(diào)節(jié)c-Myc的表達(dá)變化對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響?！卜椒ā呈褂肣RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)JMJD1A、c-Myc基因表達(dá)，CCK8用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖能力，Transwell實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲及遷移能力。〔結(jié)果〕JMJD1A高表達(dá)并且可調(diào)控c-Myc的表達(dá)，對(duì)c-Myc的表達(dá)呈正調(diào)控。在JMJD1A的表達(dá)受到干擾后，胃癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降，侵襲和遷移能力明顯降低?！步Y(jié)論〕JMJD1A能夠通過調(diào)控c-Myc表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。

JMJD1A; c-Myc; 胃癌；侵襲；細(xì)胞增殖

胃癌是世界上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。我國(guó)胃癌發(fā)病率很高，其死亡率占世界所有胃癌死亡率的一半，高于發(fā)達(dá)國(guó)家[1-2]。其發(fā)生可能與飲食習(xí)慣、幽門螺旋桿菌感染、遺傳等因素有關(guān)，且發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增高[3]。組蛋白去甲基化酶JMJD1A(Jumonji domain containing 1A)通過羥基化作用使組蛋白賴氨酸去甲基化在細(xì)胞生長(zhǎng)、組織發(fā)育和器官行程中起作用[4-5]。有研究表明，JMJD1A表達(dá)的變化與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，但在胃癌中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本研究以胃癌細(xì)胞系為材料，檢測(cè)JMJD1A在胃癌細(xì)胞的表達(dá)和調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

胃癌細(xì)胞株HGC-27和MKN-45均購(gòu)于中科院上海細(xì)胞生物所；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑和SYBR Green I試劑均購(gòu)于上海閃晶分子生物科技有限公司；Western-blot抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；CCK-8試劑和Transwell購(gòu)于Sigma公司；LV3-si-JMJD1A和LV3-NC購(gòu)于GenePharma公司。

1.2 細(xì)胞株培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞系HGC-27和MKN-45用體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并加入青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/L)，置于37 ℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)備用。

1.3 JMJD1A干擾載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

首先構(gòu)建JMJD1A干擾病毒載體LV3-si-JMJD1A及空白對(duì)照LV3-NC。將復(fù)蘇的HGC-27和MKN-45細(xì)胞接種于6孔板中(密度為2×105個(gè)/孔)，每孔3 mL。待細(xì)胞貼壁后更換新的不含雙抗而含體積分?jǐn)?shù)為5%的FBS培養(yǎng)基2 mL，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。HGC-27、MKN-45細(xì)胞MOI值為1，結(jié)合病毒滴度加入病毒液，輕輕混勻，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；過夜后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，拍照觀察。

1.4 QRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)

按照TRIzol說(shuō)明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后應(yīng)用FTC 2000進(jìn)行熒光定量PCR分析。采用2-ΔΔCt方法分析mRNA的表達(dá)，其中β-actin作為內(nèi)參。將細(xì)胞裂解提取總蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，之后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用體積分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，再用體積分?jǐn)?shù)為1%的脫脂牛奶稀釋孵育一抗4 ℃過夜(1∶500)，稀釋孵育二抗37 ℃ 1 h(1∶1 000)，暗室顯影。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

取正常培養(yǎng)的HGC-27和MKN-45細(xì)胞及轉(zhuǎn)染72 h后的HGC-27和MKN-45細(xì)胞，觀察細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞鋪板，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單個(gè)細(xì)胞，接種于96孔板中，鋪5板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每種細(xì)胞分為3組：未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空載體的NC組及轉(zhuǎn)染JMJD1A慢病毒組。分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后，每孔加入10 μL CCK8溶液(5 g/L)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)出各孔吸光值，記錄不同時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.6 細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)

用胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)5×104，接種于6孔Transwell小室，小室中鋪500 μL細(xì)胞，板孔中加入3 mL完全培養(yǎng)基。每種細(xì)胞分3組：未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空載體的NC組及轉(zhuǎn)染JMJD1A慢病毒組。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，小室用1×PBS洗2次。用刀片把小室穿透膜取下來(lái)放在載玻片上(把有透過細(xì)胞的那面朝上放，便于染色)，然后把貼有小室穿透膜的載玻片用體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗3次(5 min/次)。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Trition X-100透化細(xì)胞15 min，1×PBS洗3次，加100 μL蘇木素染色20 min。自來(lái)水洗2 min，再用新的自來(lái)水浸泡10 min反藍(lán)，用中性樹膠封片，鏡檢。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

正常培養(yǎng)的HGC-27和MKN-45細(xì)胞及轉(zhuǎn)染72 h后的HGC-27和MKN-45細(xì)胞，長(zhǎng)滿培養(yǎng)板底部。用200 μL tip頭劃痕，用PBS洗至培養(yǎng)基內(nèi)無(wú)漂浮的細(xì)胞。鏡下觀察拍照劃痕的部位，并做好標(biāo)記。并在0、36、48 h時(shí)觀察拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)值用mean±SD表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建及病毒包裝

病毒LV3-si-JMJD1A的滴度約為4×108TU/mL，LV3-NC的滴度約為3×108TU/mL。病毒滴度較高，可以用于后續(xù)的浸染胃癌細(xì)胞。

2.2 轉(zhuǎn)染干擾JMJD1A載體后基因mRNA及蛋白的表達(dá)

在HGC-27和MKN-45細(xì)胞中，JMJD1A均高表達(dá)，并且c-Myc的表達(dá)與JMJD1A的表達(dá)呈正相關(guān)。在胃癌細(xì)胞株中，干擾JMJD1A的表達(dá)后，c-Myc的表達(dá)也明顯下降(P<0.05)。見圖1。

Westernblot結(jié)果顯示，在兩組細(xì)胞系中，c-Myc的蛋白表達(dá)與JMJD1A的蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)，與圖1的結(jié)果相似。見圖2。

圖1 轉(zhuǎn)染干擾JMJD1A載體后基因mRNA的表達(dá)

圖2 轉(zhuǎn)染干擾JMJD1A載體后蛋白的表達(dá)

2.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)結(jié)果

圖3 3組細(xì)胞的增殖能力比較

圖3顯示了3組細(xì)胞的增殖能力。從圖中可以得出，在HGC-27和MKN-45細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染干擾載體組與陰性對(duì)照及空白對(duì)照組相比，細(xì)胞的增殖能力均明顯下降(P<0.05)。即干擾JMJD1A的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞增值能力降低。

2.4 細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4、圖5表明，無(wú)論是在HGC-27細(xì)胞中，還是在MKN-45細(xì)胞中，干擾JMJD1A的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞的侵襲能力都明顯下降(P<0.05)。

圖4 3組細(xì)胞電鏡下的染色圖片

圖5 3組細(xì)胞侵襲能力的比較

2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾JMJD1A的表達(dá)后，HGC-27和MKN-45細(xì)胞的遷徙能力均明顯下降，見圖6、圖7。P<0.05。

圖6 電鏡下胃癌細(xì)胞的遷徙能力

圖7 3組細(xì)胞中劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

胃癌是一種多因素影響，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的惡性腫瘤，常規(guī)的治療手段主要是手術(shù)、化療和放療，但經(jīng)常出現(xiàn)復(fù)發(fā)、腹腔轉(zhuǎn)移。腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是影響患者生存質(zhì)量的主要原因，因此，早期診斷是提高胃癌生存期的重要手段。癌基因的激活與抑癌基因的失活導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，JMJD1A的異常表達(dá)在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與遷移中起著重要作用并有可能作為治療的重要分子靶點(diǎn)。JMJD1A在多種腫瘤中高表達(dá)，比如肝癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等。Yamada等[6]發(fā)現(xiàn)，JMJD1A在肝癌組織中高表達(dá)，在缺氧條件下抑制JMJD1A表達(dá)可降低細(xì)胞生長(zhǎng)，降低侵襲能力并阻止上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)。Fan等[7]的研究顯示，JMJD1A在轉(zhuǎn)錄和翻譯上通過調(diào)節(jié)c-Myc基因的表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞的生存和增殖起關(guān)鍵作用。Zhan等[8]發(fā)現(xiàn)，JMJD1A能促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生，JMJD1A/EZH2/Let-7c可構(gòu)成一個(gè)反饋回路，有可能成為非小細(xì)胞肺癌的治療手段。

本次實(shí)驗(yàn)為探討JMJD1A在腫瘤發(fā)生的作用，通過RNA干擾技術(shù)對(duì)胃癌細(xì)胞系HGC-27和MKN-45中JMJD1A和c-Myc的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并且研究了通過JMJD1A調(diào)控c-Myc，對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，在胃癌細(xì)胞中，JMJD1A高表達(dá)并且可調(diào)控c-Myc的表達(dá)，對(duì)c-Myc的表達(dá)呈正調(diào)控。當(dāng)干擾JMJD1A的表達(dá)后，c-Myc的表達(dá)明顯下降。進(jìn)一步研究顯示，在JMJD1A的表達(dá)受到干擾后，胃癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降，侵襲能力明顯降低。由結(jié)果中可以得出，在胃癌細(xì)胞中JMJD1A的表達(dá)可調(diào)控c-Myc的表達(dá)，并呈正相關(guān)。另外，JMJD1A在胃癌細(xì)胞中可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

總之，JMJD1A通過調(diào)控c-Myc的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲的調(diào)節(jié)起重要作用。

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[責(zé)任編輯 時(shí) 紅]

Regulation of c-Myc Expression by the Histone Demethylase JMJD1A is Essntial for Gastric Cancer Cell Growth and Invasion

WANG Chaoyang1,2, LI Binghui1, ZHENG Zhongli1, MENG Jiming1, REN Xuequn1,2,3■

1. Department of Surgery, Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, China; 2. Center for Evidence-Based Medicine, Henan University, Kaifeng 475000, China; 3. Center for Translational Medicine, Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, China

〔Objective〕In this study, we aimed to explore the effects of JMJD1A on the proliferation and invasion of gastric cancer by regulating c Myc expression. 〔Methods〕 ORT PCR and Western blot were used to detect the expression of JMJD1A and c-Myc. The cell proliferation ability was detected with CCK8 methods. And Transwell analysis and Wound Healing were used to explore the abilities of invasion and migration, respectively. 〔Results〕JMJD1A was upregulated in gastric cancer cells and could regulated the expression of c Myc. The expression of c-Myc was positive correlation with JMJD1A. After interfered the expression of JMJD1A, the cell proliferation ability, invasion ability and migration ability were all decrease in the gastric cancer cells. 〔Conclusion〕Our findings identified a critical role for JMJD1A in regulating proliferation and invasion of gastric cancer cells by controlling c Myc expression.

JMJD1A; c-Myc; gastric cancer; invasion; cell growth

1672-7606(2017)02-0119-04

2017-02-21

開封市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(1407008)

王朝陽(yáng)(1987-)，男，河南臨潁人，醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤及循證外科學(xué)研究。

■通信作者：任學(xué)群(1964-)，男，河南正陽(yáng)人，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤研究及醫(yī)學(xué)教育管理。E-mail：renxuequn001@163.com。

R735.2

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