仔豬藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)病毒和鏈球菌混合感染的診斷

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

仔豬藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)病毒和鏈球菌混合感染的診斷

馬莉莉，王宇婷，倪宏波*

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

為診斷黑龍江省某豬場(chǎng)暴發(fā)的豬病，采用流行病學(xué)調(diào)查、臨床檢查和病理剖檢以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)PCR檢測(cè)、革蘭氏染色、生化試驗(yàn)等方法對(duì)無(wú)菌采集的病料進(jìn)行檢測(cè)。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示豬圓環(huán)病毒和藍(lán)耳病病毒為核酸陽(yáng)性條帶，革蘭氏染色和生化試驗(yàn)結(jié)果為鏈球菌，最終證明該群病豬為圓環(huán)病毒、藍(lán)耳病病毒和鏈球菌混合感染。本文提出了一些預(yù)防保護(hù)措施，也為豬圓環(huán)病毒病和藍(lán)耳病的防治提供了參考。

圓環(huán)病毒；藍(lán)耳病毒；鏈球菌；混合感染

豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus )是一種無(wú)囊膜的DNA病毒，圓環(huán)病毒屬成員。現(xiàn)已知PCV有兩個(gè)血清型，即PCV1和PCV2。PCV1為非致病性病毒；PCV2為致病性病毒，它是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）的主要病原[1]。PMWS最早確認(rèn)是由PCV2感染所致的疾病，常見(jiàn)PMWS主要發(fā)生在5～16周齡的豬，常見(jiàn)于6～8周齡豬，極少感染乳豬。一般斷奶后2～3 d發(fā)病，急性發(fā)病豬群病死率可達(dá)10%，但常由于并發(fā)細(xì)菌或病毒感染而增加死亡率，病死率可達(dá)25%以上[2]。豬藍(lán)耳病病毒（PRRS virus）是單股正鏈RNA病毒，是豬繁殖與呼吸綜合征的病原，該病是一種高度接觸性傳染病，呈地方流行性。PRRSV感染各種品種和年齡的豬，妊娠母豬和1月齡內(nèi)仔豬最易感[3]。主要是接觸傳播、空氣傳播和精液傳播，也可通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播。從病豬的鼻腔、糞便及尿中均可檢測(cè)到病毒。鏈球菌病(Streptococcus suis)是由鏈球菌屬中致病性鏈球菌所致的一種傳染病，多發(fā)于3～12周齡的豬，尤其是斷奶仔豬易感染此病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2016年11月2日，黑龍江省某豬場(chǎng)暴發(fā)傳染病，流行病學(xué)調(diào)查了解該豬場(chǎng)養(yǎng)仔豬20頭，母豬30頭，發(fā)病率10%，死亡率4%，豬群出現(xiàn)漸進(jìn)性消瘦，食欲不振、咳嗽、呼吸困難、體溫升高，懷孕母豬流產(chǎn)等現(xiàn)象。送檢豬表現(xiàn)為兩耳尖發(fā)紺，背部皮膚深紫色，被毛凌亂，眼睛流淚有污垢，四肢壞死，剖檢表現(xiàn)為髂下淋巴結(jié)、腹股淋巴結(jié)嚴(yán)重腫大，胃底出血，脾腫大，并且肺間質(zhì)明顯伴有出血點(diǎn)，氣管中有泡沫狀物，胸腔積液以及肋壁黏連等現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 采集病料

無(wú)菌采集病死豬的肝臟、脾臟、腎臟和淋巴結(jié)等病料用于診斷。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬瘟病毒、圓環(huán)病毒、巴氏桿菌、偽狂犬病毒和藍(lán)耳病病毒的基因序列設(shè)計(jì)特異引物，送哈爾濱博仕生物有限公司合成（表1）。

1.3 細(xì)菌分離

無(wú)菌條件采集肝臟病料，接種血脂培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)和溶血等情況。挑取疑似單菌落進(jìn)行純培于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。

1.4 生化試驗(yàn)

細(xì)菌純培養(yǎng)后，分別接種于山梨醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、乳糖、明膠、甘露醇和肌醇等系列生化培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察生化反應(yīng)特性。

1.5 藥敏試驗(yàn)

將鑒定的菌培養(yǎng)物用接種于血平板，將藥敏紙片（慶大霉素、卡那霉素、恩諾沙星等10種藥物）分別貼于平皿上37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑制菌圈直徑大小，根據(jù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.6 核酸的提取及鑒定

按照TIANamp Genomic DNA Kit和RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒分別提取DNA和RNA，做模板用豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒、圓環(huán)病毒、多殺性巴氏桿菌、鏈球菌等特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 革蘭氏染色

將分離菌進(jìn)行純培養(yǎng)后，觀察到血平板上長(zhǎng)出圓潤(rùn)、表面光滑、有乳光的細(xì)小菌落，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，見(jiàn)革蘭氏染色陽(yáng)性，染色可見(jiàn)球形、卵圓形成鏈排列的球菌，疑似鏈球菌（圖1）。

圖1 球形、卵圓形鏈狀排列的球菌

表1 引物序列

表2 生化試驗(yàn)

表3 藥敏分析

圖2 PCR電泳圖

2.2 生化鑒定

分離的細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)后，接種于山梨醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、乳糖、明膠、甘露醇和肌醇的生化培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察生化反應(yīng)特性，鑒定結(jié)果表明該菌可分解葡萄糖產(chǎn)酸，符合豬鏈球菌的生化特性（表2）。

2.4 藥敏分析

該病原菌對(duì)硫酸頭孢喹肟和頭孢唑啉高度敏感,對(duì)氟苯尼考、阿米卡星和強(qiáng)力霉素敏感，對(duì)慶大霉素、恩諾霉素、環(huán)丙沙星、林可霉素和阿奇霉素耐藥（表3）。

2.5 PCR結(jié)果

PCR或RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，第3孔在320 bp左右有一條清晰的條帶，與藍(lán)耳病病毒片段大小相符；第4孔在490 bp左右有一條清晰條帶，與圓環(huán)病毒片段大小相符（圖2）。

3 討論

通過(guò)對(duì)該豬場(chǎng)送檢的病豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)最終診斷為豬圓環(huán)病毒、藍(lán)耳病病毒和鏈球菌混合感染。調(diào)查了解到該豬場(chǎng)接種了豬瘟疫苗，但是檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抗體的水平已經(jīng)不能夠抵抗病毒，所以造成疾病的流行，對(duì)于該豬場(chǎng)提出以下幾點(diǎn)建議用于預(yù)防和控制疾病的蔓延。

1)疫苗免疫：對(duì)于健康的豬群應(yīng)及時(shí)接種疫苗，提高抵抗力，目前市面的疫苗種類多樣，要根據(jù)區(qū)域流行毒株進(jìn)行正確選擇疫苗[4]，必要時(shí)采取全群疫苗免疫的策略，圓環(huán)病毒疫苗和藍(lán)耳病疫苗可以適當(dāng)進(jìn)行同時(shí)免疫[5]，具體情況要根據(jù)實(shí)際做出調(diào)整。

2)控制種源：盡量做到自繁自養(yǎng)，嚴(yán)禁從疫區(qū)引進(jìn)種豬，豬群準(zhǔn)運(yùn)后要徹底進(jìn)行消毒，保證豬群環(huán)境的合理通風(fēng)，控制濕度和溫度，減少溫差的影響。養(yǎng)豬采用全進(jìn)全出的模式等，空置2周以上再引進(jìn)新豬群，新豬群在補(bǔ)欄前應(yīng)隔離觀察，進(jìn)行滅活疫苗的基礎(chǔ)免疫等[6]。

3)加強(qiáng)生物安全措施：規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)要進(jìn)行封閉管理，減少人員的流動(dòng)性，做好消毒工作，一旦發(fā)現(xiàn)可疑病例立即上報(bào)，做到正確的處置[7]。良好的免疫是預(yù)防的關(guān)鍵，防止豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒等病毒性疾病與巴氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌等細(xì)菌性疾病的混合感染[8]。保證血清學(xué)和抗體水平的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，免疫程序要根據(jù)豬群抗體水平進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

4）進(jìn)行安全生產(chǎn)人員的知識(shí)普及，提高其疾病的防治水平和相關(guān)的政策理解能力，定期進(jìn)行防疫管理方式的改變，在有關(guān)專家指導(dǎo)下執(zhí)行準(zhǔn)確用藥方案，預(yù)防細(xì)菌性等感染，提高整體豬群的健康水平[9]，只有這樣才能使疾病的防控工作做得更加科學(xué)、合理以及安全。

[1] 丁淑燕,朱瑞良,高玲美.豬圓環(huán)病毒的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2004,31（3）：41-43.

[2] 樊福好.PMWS 的診斷與防制措施[J].河北畜牧獸醫(yī),2003（4）：35-36.

[3] 田克恭.高致病性豬藍(lán)耳病流行現(xiàn)狀與免疫防控進(jìn)展 [J].中國(guó)豬業(yè) ,2010(6)﹕9-11.

[4] 康麗娟，張鳳玲，于德和，等.豬圓環(huán)病毒?、蛐偷脑\斷與防治[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2005（10）：27-28.

[5] 宋長(zhǎng)緒，梁鵬帥. 豬圓環(huán)病毒病(PCVD)研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010 ，37(9)：34-37.

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[8] 張文奎.豬肺疫的診斷與防制[J]. 山東畜牧獸醫(yī)，2013 (3)：21-22.

[9] 夏偉,蔡高忠,張宇輝，等.高致病性藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒病繼發(fā)副豬嗜血桿菌感染的診斷和綜合控制措施[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息,2011(4)﹕5-8．

2016-12-07）

馬莉莉 (1992-) 女，黑龍江人，在讀碩士，研究方向?yàn)榉肿蛹?xì)菌學(xué)和免疫學(xué)

*通訊作者：倪宏波(1972-)男，黑龍江人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)研究