芪芍復(fù)脈湯對大鼠缺血下肢骨骼肌毛細(xì)血管密度的影響

孫超楠，李廷荃，王雁彬

芪芍復(fù)脈湯對大鼠缺血下肢骨骼肌毛細(xì)血管密度的影響

孫超楠1，李廷荃2，王雁彬2

目的 觀察芪芍復(fù)脈湯對大鼠缺血下肢毛細(xì)血管密度(MVD)的影響。方法 健康SD大鼠行左下肢股動脈結(jié)扎、分支剔除術(shù)，制作下肢缺血模型。隨機分為模型組，芪芍復(fù)脈湯高、中、低劑量組和G-CSF組，并設(shè)立假手術(shù)組，假手術(shù)組僅暴露股動脈。術(shù)后第2天開始給藥，分別于3 d、7 d、14 d，檢測外周血酶學(xué)變化；取患側(cè)內(nèi)收肌檢測毛細(xì)血管密度，比較各組差異。結(jié)果 術(shù)后7 d、14 d，芪芍復(fù)脈湯高、中劑量組MVD值顯著高于模型組和芪芍復(fù)脈湯低劑量組(P<0.01)，術(shù)后14 d，芪芍復(fù)脈湯高劑量組高于芪芍復(fù)脈湯中劑量組(P<0.05)。結(jié)論 芪芍復(fù)脈湯可增加缺血下肢骨骼肌毛細(xì)血管密度，改善缺血狀態(tài)，促進(jìn)血管新生。

芪芍復(fù)脈湯；下肢缺血； 血管新生；毛細(xì)血管密度

下肢缺血性疾病是由于下肢動脈的耗氧量與供氧量之間的不平衡所導(dǎo)致的下肢疾病，以動脈硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎最為常見，嚴(yán)重影響著病人的生活質(zhì)量，甚至危及生命，人們對其一直束手無策。近年來血管新生技術(shù)的出現(xiàn)和中醫(yī)藥治療為下肢缺血性疾病治療帶來了新曙光[1-3]。本實驗通過結(jié)扎股動脈制造大鼠下肢缺血模型，觀察芪芍復(fù)脈湯對缺血大鼠骨骼肌毛細(xì)血管密度的影響，初步探討芪芍復(fù)脈湯對缺血下肢血管新生的作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠下肢缺血模型的建立 SD大鼠108只，雄性，6月齡，體質(zhì)量250 g～300 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SCXK(軍)2014-0004。常規(guī)飼養(yǎng)一周后，隨機分為模型組和假手術(shù)組。3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)行大鼠腹腔

注射麻醉，選左側(cè)腹股溝中點向膝部作一長度約2 cm的縱行切口，緊貼腹股溝下方分離股動脈主干，行股動脈結(jié)扎、離斷及分支剔除術(shù)，制造下肢缺血模型。假手術(shù)組僅暴露股三角，不結(jié)扎動脈及其分支，術(shù)后連續(xù)3 d對大鼠下肢肌肉注射抗生素(青霉素8 U)，預(yù)防感染。

1.2 動物分組 將造模成功的大鼠，按隨機數(shù)字表法分為5組，模型組、芪芍復(fù)脈湯高劑量組、中劑量組、低劑量組、粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)組，每組18只。

1.3 給藥方法 芪芍復(fù)脈湯，組方：黃芪30 g，當(dāng)歸15 g，桂枝15 g，麥冬10 g，赤芍15 g，川芎10 g，三七3 g，丹參30 g，土元6 g，全蝎6 g，川牛膝30 g，甘草6 g。廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)顆粒劑，1 g顆粒折合生藥量4.5 g ，根據(jù)藥物的溶解性確定最大給藥濃度，以此作為高劑量給藥濃度，一半為中劑量給藥濃度，四分之一為低劑量給藥濃度。給藥劑量高劑量組7.6g/(kg·d) ，相當(dāng)于60 kg體重成人用量的12倍、中劑量組3.8 g/(kg·d) ，相當(dāng)于60 kg體重成人用量的6倍、低劑量組1.9 g/(kg·d) ，相當(dāng)于60 kg體重成人用量的3倍，加溫開水至10 mL，1 mL/100 g ，模型組和假手術(shù)組灌服蒸餾水，1 mL/100 g，每天1次，連續(xù)14 d。陽性對照藥：rhG-CSF：200 μg/1.2 mL， 購自山東齊魯制藥有限公司，批號S19990049。用生理鹽水稀釋至12 mL 備用，予rhG-CSF組大鼠患肢皮下注射[4]，注射量：0.21 mL/100 g (相當(dāng)于60 kg體重成人用量的7倍)， 日一次 ，連續(xù)5 d。

1.4 主要試劑與儀器 肌酸激酶(CK)測定試劑盒(貝克曼庫爾特；批號LOT8537)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測定試劑盒(貝克曼庫爾特，批號：AUZ3555)；CD34抗體，購自英國abcam公司，批號：ab8158；二抗(HRP山羊抗兔鼠通用)購自丹麥DAKO公司，貨號：K5007；組化試劑盒DAB顯色劑購自丹麥DAKO公司，貨號：K5007。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 酶學(xué)檢測 術(shù)后3 d、7 d、14 d，大鼠下腔靜脈抽取血液3 mL，測外周血肌酸激酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶。

1.5.2 免疫組化測定缺血組織中毛細(xì)血管密度 術(shù)后3 d、7 d、14 d，取大鼠患側(cè)缺血內(nèi)收肌，石蠟切片脫蠟至水，EDTA抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后，用3%過氧化氫溶液溫室避光孵育25 min，用3% BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min，滴加一抗，4 ℃孵育過夜， PBS 緩沖液洗滌 5 min×3次，滴加第二抗體，室溫37 ℃孵育20 min，PBS 緩沖液洗滌 5 min×3次，DAB顯色，復(fù)染后脫水，中性樹膠封片。進(jìn)行400倍的顯微照相。應(yīng)用IPP6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，CD34抗體著色顯示組織的微血管密度，采集5個視野下的陽性血管數(shù)量，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠下肢缺血模型建立情況 結(jié)扎、離斷大鼠下肢股動脈及其分支的造模效果顯著，除假手術(shù)組外，其余各組均有不同程度的活動障礙，6組大鼠下肢未見壞死。

2.2 外周血酶檢測結(jié)果 假手術(shù)組3 d和7 d無統(tǒng)計學(xué)意義；術(shù)后各時間點模型組酶學(xué)指標(biāo)水平均較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)，術(shù)后3 d，各組AST水平均較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)；模型組、低劑量組較高劑量組和rhG-CSF組顯著升高(P<0.01)，較中劑量組顯著升高(P<0.05)；rhG-CSF組的CK值低于模型組(P<0.05)。術(shù)后7 d各組AST、CK值均下降，且高、中劑量組、rhG-CSF組較模型組和低劑量組術(shù)后14 d，AST、CK值與7 d時比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與3 d比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且高、中劑量組和rhG-CSF組的CK值與模型組比較下降顯著(P<0.05)。詳見表1、表2。

表1 各組大鼠不同時間點外周血AST比較(±s) U/L

表2 各組大鼠不同時間點外周血CK比較(±s) U/L

2.3 毛細(xì)血管密度(MVD)測定結(jié)果 術(shù)后3 d，各組間MVD值無統(tǒng)計學(xué)意義；術(shù)后7 d，各組間總體不全相同，rhG-CSF組、芪芍復(fù)脈湯高、劑量組較模型組和低劑量組顯著上升(P<0.01)，中劑量組較模型組上升(P<0.01)，rhG-CSF組與高劑量組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后14 d，各組間總體不全相同，rhG-CSF組、芪芍復(fù)脈湯高劑量組較模型組和低劑量有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，中劑量組較模型組顯著升高(P<0.05)，高劑量組高于中劑量組(P<0.05)，高劑量組與G-CSF組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。詳見表3。

表3 各組大鼠不同時間點MVD值比較(±s) 個/視野

3 討 論

3.1 MVD與血管新生 血管新生是一個極其復(fù)雜的過程，它是在原有血管基礎(chǔ)上，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過發(fā)芽或嵌入的方式，形成新的血管網(wǎng)的過程[5]。而這一過程是在機體缺血缺氧或炎癥等應(yīng)激狀態(tài)下才會被啟動。其過程主要可以概括為：血管基膜及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白融解、內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)游走、增埴和分化，黏附并形成新的基膜，管腔形成并重塑成新的血管網(wǎng)[6]。血管新生可以建立有效的側(cè)支循環(huán)、改善微循環(huán)，維持缺血組織的血流供應(yīng)，恢復(fù)組織器官的功能，為缺血性疾病的治療帶來突破性的進(jìn)展。目前實驗普遍采用MVD作為檢測血管新生水平的主要指標(biāo)，被公認(rèn)為評價血管新生強度的標(biāo)志。MVD檢測結(jié)果越高，說明血管新生越活躍[7]。本實驗研究顯示：術(shù)后7 d和 14 d，芪芍復(fù)脈湯高、中劑量組MVD值較模型組顯著升高，并且術(shù)后14 d，高劑量組與西藥對照組MVD值無明顯差異，說明芪芍復(fù)脈湯能夠增加大鼠下肢缺血模型骨骼肌毛細(xì)血管密度，促進(jìn)血管新生。

3.2 酶學(xué)與組織缺血的關(guān)系 酶學(xué)的變化在一定程度上反映了組織缺血的嚴(yán)重程度[8]。正常情況下，AST、CK等酶絕大多數(shù)存在于骨骼肌等肌肉組織中，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外周血中的含量，血液中的AST、CK升高一般提示已有肌肉損害或正發(fā)生肌肉損害。實驗中，結(jié)扎股動脈及其分支造成下肢缺血模型，使局部組織缺血缺氧，使細(xì)胞膜通透性增高，加速細(xì)胞內(nèi)酶進(jìn)入外周血中，引起血清中酶的異常升高，但在后期外周血中的酶呈下降趨勢，說明下肢缺血狀態(tài)正在得到改善。說明芪芍復(fù)脈湯能夠改善肢體的缺血狀態(tài)。

3.3 芪芍復(fù)脈湯與血管新生 祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，下肢缺血性疾病屬中醫(yī)“血”“脈”的范疇，“脈”與近代所述的“血管”無論在形態(tài)還是功能上都存在對應(yīng)關(guān)系。因此認(rèn)為，血管新生的過程實際上就是“復(fù)脈”的過程。本病病機以氣血虧虛為本，瘀血阻塞為標(biāo)，導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)阻塞不通。芪芍復(fù)脈湯是治療下肢缺血性疾病的效驗方，是李廷荃教授多年臨床經(jīng)驗的總結(jié)，方中、黃芪，補氣，固本，使氣旺則血行；三七、川芎、赤芍、丹參，活血祛瘀、行氣止痛；土元、全蝎借其行散走竄之力，搜風(fēng)通絡(luò)，解痙止痛；川牛膝為血肉友情之品，既可助活血化瘀，強筋骨，壯腰膝，又可借其沉降之性引藥下行直達(dá)病所；配伍麥冬、當(dāng)歸養(yǎng)陰增液補血，使陰血充，脈絡(luò)盈；桂枝助陽化氣，溫通經(jīng)脈，發(fā)越陽氣，溫養(yǎng)肌膚[9-10]。通過補血養(yǎng)血而充脈絡(luò)，益氣以生血、行血，養(yǎng)陰血以增津液，活血化瘀以通脈絡(luò)，使正氣壯，瘀血除，新血生，血供改善，從而減輕肢體不適癥狀。

芪芍復(fù)脈湯能夠增加缺血骨骼肌的毛細(xì)血管密度，為臨床治療提供了可靠。術(shù)后14 d，芪芍復(fù)脈湯高劑量組和中劑量組MVD值明顯高于低劑量組，且高劑量組顯著高于中劑量組，說明芪芍復(fù)脈湯不僅能夠促進(jìn)下肢缺血模型的血管新生，而且其療效存在劑量依賴性，為臨床治療下肢缺血性疾病最佳藥物劑量療效的確立提供實驗支持。

芪芍復(fù)脈湯具有促進(jìn)下肢缺血模型血管新生的作用，其具體的作用機制還有待進(jìn)一步的實驗證實。

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(本文編輯王雅潔)

1.山西省中醫(yī)藥研究院研究生在讀(太原 030012)；2.山西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

李廷荃， E-mail： 342800672@qq.com

信息：孫超楠，李廷荃，王雁彬.芪芍復(fù)脈湯對大鼠缺血下肢骨骼肌毛細(xì)血管密度的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(12)：1450-1453.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.12.008

1672-1349(2017)12-1450-04

2016-10-09)