新生大鼠心臟再生模型的改良及評價(jià)模式

朱浩,丁勝光,黃海濤,許嘉鴻,仲崇俊

(1.南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科,江蘇南通 226001; 2.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科,上海 200065)

新生大鼠心臟再生模型的改良及評價(jià)模式

朱浩1,丁勝光1,黃海濤1,許嘉鴻2,仲崇俊1

(1.南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科,江蘇南通 226001; 2.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科,上海 200065)

探索改良新生大鼠心臟再生模型并進(jìn)行初步評價(jià),以優(yōu)化哺乳動物在體心臟再生模型.取出生12 h左右的大鼠,采用低溫麻醉行心尖切除改良術(shù),術(shù)后統(tǒng)計(jì)1,3,7和21 d存活率,并取材測量切除的心尖橫截面積來評估改良術(shù)的效果.術(shù)后1 d對照組存活率為61%,改良組為77%,并且改良組術(shù)后3,7,21 d的存活率都高于對照組.改良組心尖切除的橫截面積變異較小,說明新生大鼠心臟再生模型改良術(shù)均一穩(wěn)定,手術(shù)成功率高,可用于哺乳動物心臟再生相關(guān)基因和信號通路的研究.

心臟再生;細(xì)胞增殖;心尖切除

隨著人們生活水平的改善,心血管疾病的發(fā)病率逐年升高.冠心病患者在發(fā)病后心肌受損、壞死,心功能急劇下降,常導(dǎo)致死亡.近二十年來,隨著診療技術(shù)的發(fā)展,心血管疾病的病死率已經(jīng)顯著下降[1].然而,由于心臟損傷后心肌細(xì)胞不能有效再生,導(dǎo)致心血管疾病進(jìn)入慢性階段后的病死率仍居高不下,且目前尚無有效的治療手段[2].心肌細(xì)胞的再生和修復(fù)研究還處于初級階段,越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,雖然成年哺乳動物的心臟在心肌受損后無法完全再生,但是新生的心肌細(xì)胞能進(jìn)行自身分裂和再生,參與心臟自穩(wěn)態(tài)的維護(hù)和病變組織的修復(fù)[3].因此,激活心臟內(nèi)源性再生潛能具有重大的研究意義[4-5].

已有研究表明,成年斑馬魚心臟即便切除心室體積的20%,依舊能非瘢痕性完全再生[6].這一修復(fù)過程主要是心肌細(xì)胞的增殖[7-8].哺乳動物與魚心臟的基本結(jié)構(gòu)有很大差異,哺乳動物心臟為4個(gè)腔室雙循環(huán),心臟負(fù)荷壓力也比雙腔單循環(huán)的魚類更大.哺乳動物的心肌細(xì)胞在出生后即退出細(xì)胞周期變?yōu)殡p核細(xì)胞[9-10],而斑馬魚的心肌細(xì)胞為單核,終身保持增生活性.有研究表明,成年斑馬魚的心臟更接近于尚未分隔的胚胎期哺乳動物的心臟,胚胎期哺乳動物的心臟在損傷后也能激活增生性反應(yīng),這提示哺乳動物早期心臟有再生的能力[3,11-13].為了明確新生鼠心臟在組織學(xué)水平對損傷的反應(yīng),有學(xué)者切除新生1 d小鼠心尖部心肌(約占心室的10%),通過一系列組織學(xué)分析方法檢測到小鼠心肌損傷后的再生過程,并發(fā)現(xiàn)在21 d內(nèi)被切除的心肌細(xì)胞得以完全修復(fù),且心肌細(xì)胞的收縮功能恢復(fù)正常.心尖切除8周后,通過心臟B超發(fā)現(xiàn)小鼠左室射血分?jǐn)?shù)(ejection fractions,EF)正常,與假手術(shù)組無差異.新生小鼠心肌細(xì)胞具有增殖潛能[14],這已被磷酸化H3組蛋白(phosphohistone H3,pH3)和極光激酶B與心肌肌鈣蛋白的共定位證實(shí),說明心肌細(xì)胞具有一定的有絲分裂與胞質(zhì)分裂的能力.當(dāng)心肌細(xì)胞增殖時(shí),肌節(jié)會發(fā)生標(biāo)志性的形態(tài)學(xué)改變,在有絲分裂過程中,肌節(jié)結(jié)構(gòu)會發(fā)生邊集效應(yīng)向細(xì)胞周邊分散[14].這種效應(yīng)在心尖切除術(shù)后7 d達(dá)到頂峰,并且不僅僅局限在心尖部,在整個(gè)心臟都會發(fā)生,這表明具有分化和增殖潛能的心肌細(xì)胞廣泛分布于新生小鼠的心臟.

盡管以上研究已證實(shí)了新生小鼠心尖切除可作為一種心臟再生模型,并提供了各類反應(yīng)心肌細(xì)胞再生的研究參數(shù),但還沒有建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),心尖切除未能實(shí)現(xiàn)定量均一化.本實(shí)驗(yàn)嘗試通過對新生大鼠行心尖切除術(shù)探索改良心臟再生模型,并試圖建立一種初步的評價(jià)方式.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與器械

(1)實(shí)驗(yàn)動物：SPF級雄性SD大鼠,3～4月齡,體質(zhì)量250～300 g;SPF級雌性SD大鼠, 3～4月齡,體質(zhì)量200～250 g,由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供;新生大鼠,<12 h.新生大鼠因性別無法區(qū)分未設(shè)定性別比例.所有操作均依照美國國立衛(wèi)生院(National Institutes of Health)的相關(guān)規(guī)定.

(2)實(shí)驗(yàn)器械：體視顯微鏡、光源、微型臺式真空泵、加熱墊.顯微外科手術(shù)器械：蚊剪、直鑷、彎鑷、顯微尖鑷、顯微彎鑷.7-0手術(shù)縫合線,8-0手術(shù)縫合線,真空泵外接移液槍200μL黃色槍頭,冰盒,10 mm培養(yǎng)皿,紗布,碘伏棉棒等.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 新生大鼠準(zhǔn)備

將SPF級雄性與雌性SD大鼠合籠飼養(yǎng),按1∶1合籠.雌鼠懷孕14 d(E14)后可看到腹部隆起,此時(shí)可將雌鼠分出置于單籠中飼養(yǎng),早晚各一次查看大鼠出生情況并記錄出生時(shí)間.本實(shí)驗(yàn)取出生<12 h的新生大鼠進(jìn)行造模.

1.2.2 新生大鼠心尖切除改良術(shù)

手術(shù)過程如圖1所示,具體如下.

(1)將新生大鼠用紗布包裹置于冰上3～5 min進(jìn)行低溫麻醉(見圖1(a)),要頻繁檢測其爪反射,過長時(shí)間置于低溫中會增加術(shù)后死亡率.新生大鼠在低溫狀態(tài)下呼吸心跳可完全停止,因此可在無需通氣的情況下完成心尖切除手術(shù),手術(shù)過程最好不超過10 min.

(2)將新生大鼠用消毒紗布擦凈置于手術(shù)區(qū),保持仰臥位,用碘伏棉棒消毒手術(shù)區(qū)域3遍(見圖1(b)).

(3)于新生大鼠兩腋水平連線下方約1 cm處做平行于肋間隙的水平切口(見圖1(c)).切口的選擇至關(guān)重要,精準(zhǔn)地找到最佳切口有利于順暢地進(jìn)入胸腔使心尖完美暴露,并能使肺部損傷最小化.手術(shù)過程中切勿用顯微尖鑷粗暴夾持皮膚,否則會造成復(fù)雜性傷口撕裂傷.擴(kuò)大的切口雖然能有助于進(jìn)胸,擴(kuò)大視野,但會使傷口愈合減緩造成母鼠食子,不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行.

(4)在第四或第五肋間用顯微彎鑷逐層鈍性分離肋間肌肉,緩慢進(jìn)入胸腔(見圖1(d)),形成長度約2 cm的開口.當(dāng)打開胸膜后空氣涌入左側(cè)胸腔,左肺被壓縮貼近至背側(cè),此時(shí)可見到停搏的心臟.在配有光源的體視顯微鏡下用顯微彎鑷鈍側(cè)小心打開心包膜,切勿損傷心臟及周圍肺組織.此時(shí)左手捏起新生大鼠背側(cè)皮膚,右手拇指按壓新生大鼠腹部,心臟會突出于胸壁(見圖1(e)).

圖1 手術(shù)過程Fig.1 Surgical procedure

(5)找到左室心尖部,用微型臺式真空泵通過細(xì)軟管外接200μL的黃色槍頭(見圖1(f)),槍頭開口直徑調(diào)至約3 mm,定量真空泵吸引力,用槍頭柔和地將心尖吸牢,直至沒有空氣抽吸聲.操作過程中吸引力不可過大,以免損傷心肌組織.此時(shí),用7-0手術(shù)縫合絲線緊貼槍頭下緣并環(huán)繞切割(見圖1(g)),可平整地切除心尖組織.

(6)用8-0手術(shù)縫合線逐層關(guān)胸(見圖1(h)).縫合時(shí)進(jìn)針方向盡量平行貼近胸壁,避免戳破肺組織.手術(shù)結(jié)不可太緊以免勒斷肋骨,導(dǎo)致死亡率增加.

(7)用8-0手術(shù)縫合線縫合表皮.縫合后用濕紗布將新生大鼠身上殘留的血跡擦干,并用酒精棉棒消毒傷口(見圖1(i)),以減少感染幾率,避免造成母鼠食子.

(8)將做完手術(shù)的新生大鼠輕輕握在手中,并置于暖風(fēng)機(jī)下使其迅速復(fù)溫,待新生大鼠有自主呼吸后置于加熱墊上,溫度不可過高,并用母鼠籠中的敷料覆蓋,待所有新生大鼠術(shù)后恢復(fù)后可一起放入母鼠籠中.

1.2.3 心臟的取材及固定

(1)準(zhǔn)備心臟停搏液(KCl溶于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS),最終濃度為50 mmol/L),體積分?jǐn)?shù)為3.7%的多聚甲醛備用.術(shù)前10 min在新生大鼠腹膜下注射50μL的肝素.

(2)通過頸脫位法使新生大鼠安樂死,擺為仰臥體位,用膠布固定四肢及尾巴,用顯微剪在整個(gè)腹部做橫切口,然后由兩側(cè)垂直往上延伸直至膈肌顯露.

(3)用彎鑷提起胸骨暴露膈肌,然后將膈肌小心地從前胸壁上鈍性分離下來,可暴露胸腔.

(4)彎鑷從心臟下方走行,夾住主動脈等大血管將心臟小心上提,用蚊剪在彎鑷下方離斷血管,取出心臟置于冷凍的心臟停搏液中.取出心臟時(shí)若有黏連,在體視鏡下用顯微尖鑷小心分離組織.當(dāng)不確定黏連物是否為心臟組織時(shí),保留于心臟上,在固定時(shí)其可自行脫落.

(5)在心臟停博液中用彎鑷平行于心臟長徑輕輕擠壓,排出心腔內(nèi)殘余的血.

(6)將取下的心臟置于多聚甲醛中固定,4?C過夜.第二天吸出多聚甲醛換為PBS后室溫振蕩5 min,重復(fù)此過程3次.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.計(jì)量資料呈正態(tài)分布,用±s表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn).P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)采用低溫麻醉,新生大鼠呼吸停止,心臟停博,無麻醉意外發(fā)生.總計(jì)78只大鼠, sham組6只大鼠全部存活.術(shù)后1 d,對照組36只大鼠存活22只,存活率為61%;手術(shù)改良組36只大鼠存活28只,存活率為77%,死亡22只的原因可能為母鼠吞食、肺部損傷等.術(shù)后1～21 d存活結(jié)果如圖2所示.

2.2 對照組與改良組效果比較

取16只體重相近的新生大鼠隨機(jī)分配成兩組,將心尖切除后新生大鼠的心臟取出,用體積分?jǐn)?shù)為3.7%的多聚甲醛固定,將各組8只心臟心尖朝上置于同一視野中拍照(見圖3(a)),隨后用軟件ImageJ將心尖切除后的橫截面積圈出(見圖3(b)),并求變異系數(shù)(coefficient of variance,CV)(見表1).CV可比較均數(shù)有差異的兩組數(shù)據(jù),排除平均水平的影響.

圖2 術(shù)后1～21 d存活結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.2 Postoperative survival rate at 1—21 d

圖3 心尖切除結(jié)果Fig.3 Results of apex section

3 討論

心臟再生是全球醫(yī)學(xué)研究的重要課題.最初有學(xué)者嘗試誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞分化研究心臟再生[15-16],也有學(xué)者采取新的研究方法來識別心肌祖細(xì)胞[17],激活心臟外膜的祖細(xì)胞再生[18].另外,有報(bào)道稱受損的心肌成纖維細(xì)胞可以重新分化為心肌細(xì)胞[19],或者心肌細(xì)胞本身可以增殖[20].但目前已知研究成果還不足以解釋再生如何修復(fù)壞死區(qū)域及恢復(fù)心臟功能[21].當(dāng)已有研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚心尖被切除后可以再生,人們推測新生鼠心尖切除后也有可能再生[8,22].因此新生鼠心臟再生模型的創(chuàng)建為哺乳動物心臟再生的研究打開了一扇嶄新的大門[23].如何保持再生模型的均一穩(wěn)定性目前頗有爭議,尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[24].相對于新生小鼠而言,新生大鼠數(shù)量充足、存活率高、便于操作,因此本工作探索了新生大鼠心尖切除改良術(shù),并詳細(xì)闡明了每一步操作方法,以期為其他研究者更好地研究心臟再生原理提供參考.

表1 對照組和改良組變異系數(shù)Table 1 CVs of the control and the improved group

新生大鼠心臟再生模型創(chuàng)建面臨的首要問題是新生鼠心臟體積小,不易操作.因此手術(shù)者對于自身基本技能的訓(xùn)練至關(guān)重要.判斷技能是否合格的一項(xiàng)重要指標(biāo)便是手術(shù)存活率.在本工作的手術(shù)過程中,將新生大鼠用紗布包裹置于冰上3～5 min,避免與冰直接接觸造成組織凍傷,并頻繁檢測其爪反射,防止過長時(shí)間置于低溫中增加術(shù)后死亡率,且全程最好不超過10 min.切口位置、大小的選擇亦至關(guān)重要,不當(dāng)?shù)牟僮鲿?dǎo)致傷口愈合緩慢,使死亡率升高.

已有研究發(fā)現(xiàn),心尖切除大小對新生大鼠心臟的再生影響很大[25].新生大鼠心臟再生模型面臨的另一個(gè)重要挑戰(zhàn)便是如何使手術(shù)模型均一穩(wěn)定化.本工作使用定量微型臺式真空泵負(fù)壓吸力,取用合適口徑的槍頭(d=3 mm),確保每次吸取的心尖部肌肉占心室體積的10%左右,再用7-0手術(shù)縫合線環(huán)繞槍頭尖端切割,可形成光滑均一的切口,避免因無參照物切割帶來的一系列干擾誤差.術(shù)后統(tǒng)計(jì)了存活率,術(shù)后1 d對照組存活率為61%,改良組為77%,并且改良組術(shù)后,3,7,21 d的存活率都高于對照組.隨后,用軟件ImageJ求出切除心尖的橫截面積,得到兩組數(shù)據(jù)的方差,可發(fā)現(xiàn)改良組組內(nèi)差異較小.本工作改良的模型可用于哺乳動物心臟再生機(jī)理及相關(guān)藥物的開發(fā)研究,可結(jié)合成年鼠心肌梗死模型、急性缺血再灌注模型闡述細(xì)胞增殖分化相關(guān)信號通路及細(xì)胞周期相關(guān)基因?qū)π呐K再生的作用,并可在此基礎(chǔ)上對藥物的治療效果進(jìn)行評價(jià).

綜上所述,新生大鼠心尖切除能激活心肌細(xì)胞增殖,促進(jìn)心臟結(jié)構(gòu)和功能完整性的恢復(fù).在大鼠出生7 d后,心肌細(xì)胞的再生能力明顯下降,這與心肌細(xì)胞變?yōu)殡p核細(xì)胞退出細(xì)胞周期的時(shí)間相吻合.發(fā)育成熟的心臟喪失再生潛能可能與固有細(xì)胞周期被阻滯或有絲分裂刺激源丟失有關(guān).目前已有研究表明,心肌細(xì)胞的增殖可能在新生大鼠心臟再生過程中扮演重要角色,同時(shí)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的作用也不容忽視.本工作嘗試了一種全新的新生大鼠心臟再生模型,并提出了一種評估手術(shù)均一性的方式,以期為未來更多的心臟再生研究提供一定的幫助與借鑒.

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Improvement and preliminary evaluation of neonatal rat cardiac regeneration model

ZHU Hao1,DING Shengguang1,HUANG Haitao1, XU Jiahong2,ZHONG Chongjun1
(1.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,The Second Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001,Jiangsu,China; 2.Department of Cardiology,Tongji Hospital Affiliated to Medical College of Tongji University, Shanghai 200065,China)

An improved neonatal rat cardiac regeneration model was established and a preliminary evaluation was conducted.Neonatal rats of 12 h and exercised apical resection surgery with low-temperature anesthesia were used.Postoperative survival rates were taken on 1,3,7 and 21 d,and the cross-sectional area were measured to evaluate the advantage of the improved technique.In the control group,postoperative survival rate at 1 d was 61%, while the improved group was 77%.In addition,survival rates of the improved group on 3,7 and 21 d were higher than that in the control group.Variation of resected apex crosssectional area was smaller in the improved group.In conclusion,the improved neonatal rat cardiac regeneration model is more stable and more uniform with a higher operation success rate.This model may be used to investigate genes and the signaling pathways mediating mammalian heart regeneration.

heart regeneration;cell proliferation;apical resection

R 541

A

1007-2861(2017)03-0387-08

10.12066/j.issn.1007-2861.1938

2017-04-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81670362,81470515);上海市科委醫(yī)學(xué)引導(dǎo)(重點(diǎn))基金資助項(xiàng)目(134119a3000)

仲崇俊(1962—),男,主任醫(yī)師,博士,研究方向?yàn)樾呐K再生.E-mail：chongjunzhong@hotmail.com