• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖所致心肌細(xì)胞鈣超載和細(xì)胞凋亡的影響

    2017-07-19 11:45:56李銀科史瓊枝廖翔茹謝向陽
    武警醫(yī)學(xué) 2017年7期
    關(guān)鍵詞:鈣超載利拉魯高糖

    李銀科,史瓊枝,陳 晨,廖翔茹,謝向陽

    ?

    利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖所致心肌細(xì)胞鈣超載和細(xì)胞凋亡的影響

    李銀科,史瓊枝,陳 晨,廖翔茹,謝向陽

    目的 研究利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖所致心肌細(xì)胞鈣超載和細(xì)胞凋亡的影響。方法 采用原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞,建立缺氧和高糖模型。實(shí)驗(yàn)分為:正常對(duì)照組、利拉魯肽對(duì)照組、缺氧和高糖模型組、利拉魯肽處理組、胰高血糖素樣肽-1 (glucagon like peptide-1, GLP-1)受體抑制劑組、高滲對(duì)照組6組。采用熒光分光光度法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化,化學(xué)熒光法檢測(cè)活性氧族(reactive oxygen species, ROS)水平、利用生化方法檢測(cè)Ca2+-ATP 和Na+-K+-ATP酶活性、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)鈣敏感的鈣蛋白酶(μ-calpain)基因表達(dá)、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率、ELISA法檢測(cè)細(xì)胞caspase-3活性。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比,缺氧高糖模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平、μ-calpain mRNA表達(dá)量、caspase-3活性均顯著升高(P<0.01);Ca2+-ATP 和Na+-K+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01);游離鈣離子濃度由(117.19±15.04)nmol/L增加至(508.53±26.11)nmol/L,細(xì)胞凋亡率由(3.95±0.12)%增加至(31.03±4.30)%(P<0.01)。利拉魯肽處理組細(xì)胞較缺氧高糖模型組上述參數(shù)均明顯改善,游離鈣離子濃度和細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01);GLP-1R抑制劑exendin(9-39)可拮抗利拉魯肽的上述作用(P<0.05)。結(jié)論 利拉魯肽可明顯抑制缺氧和高糖所致心肌細(xì)胞鈣超載及μ-calpain基因的上調(diào),降低caspase-3水平,減少心肌細(xì)胞凋亡,對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

    利拉魯肽;心肌細(xì)胞;缺氧;高糖;鈣超載;凋亡

    糖尿病是心血管疾病最常見的易患因素之一,同時(shí)也是心肌梗死的獨(dú)立高危因素[1],對(duì)心血管疾病的治療及預(yù)后產(chǎn)生重要的影響。高糖和缺氧也是臨床常見的心肌損傷因素,高糖導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化[2],缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死[3],最終都造成心肌細(xì)胞數(shù)量減少,心肌收縮力減弱,對(duì)心臟功能造成不可逆損傷。已有證據(jù)表明,心血管并發(fā)癥在糖尿病人群的致死率是非糖尿病人群的3~5倍[4],缺血性心臟病在糖尿病人群的發(fā)病率是非糖尿病人群的2倍[5]。利拉魯肽是胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)的類似物,目前主要應(yīng)用于2型糖尿病的治療。最新的研究發(fā)現(xiàn),利拉魯肽在發(fā)揮降糖作用的同時(shí)還具有一定的心肌保護(hù)作用[6],但對(duì)其藥理作用機(jī)制的研究尚不完善。本研究采用體外培養(yǎng)高糖孵育的乳鼠心肌細(xì)胞經(jīng)缺氧處理,模擬糖尿病心肌細(xì)胞缺血損傷病理過程,從抑制鈣超載和心肌細(xì)胞凋亡的角度,探討利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 試藥和儀器 利拉魯肽注射液(Novo Nordisk公司,丹麥),二甲基亞砜( DMSO)(Amresco 公司,美國(guó)),DMEM/F-12培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco公司,美國(guó)),5-溴-2-脫氧尿嘧啶(Brdu)、TritonX-100、胰蛋白酶、exendin-4(9-39)(Sigma公司,美國(guó)),F(xiàn)ura-2/AM(Biotium公司,美國(guó)),D-葡萄糖(天津市福晨化學(xué)試劑廠),ROS檢測(cè)試劑盒、Ca2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP酶測(cè)定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所),Annexin-V-FLUOS Staining KIT(BD公司,美國(guó)),caspase-3 ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D公司,美國(guó)),μ-calpain引物(Takara公司)二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司,美國(guó)),醫(yī)用型超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F,蘇州),倒置相差顯微鏡(CK-40,日本Olympus),數(shù)字式測(cè)氧儀(CYS-1型,北京),酶標(biāo)儀(BIO-RAD,美國(guó)),熒光分光光度計(jì)(RF-5301PC,日本島津)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生1~3 d的SD乳鼠,雌雄不限,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào):SCXK-(軍)2012-004。

    1.3 方法

    1.3.1 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 新生l~3 d的SD乳鼠用75%乙醇消毒后,取出心臟置于預(yù)冷的D-Hanks液中,將心室肌剪成約1 mm3大小組織塊,加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA),于37 ℃消化并離心收集心肌細(xì)胞,加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液和Brdu(終濃度0.1 mmol/L)接種于25 ml培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)4 d后采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率[7]。

    1.3.2 心肌細(xì)胞缺氧高糖模型的建立 取培養(yǎng)4 d的心肌細(xì)胞,換用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后,換用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F-12培養(yǎng)液(預(yù)先充入95%N2+5%CO2混合氣飽和30 min),替代正常培養(yǎng)液,而后迅速將培養(yǎng)板移入通有95%N2+5%CO2混合氣的缺氧裝置中,維持氧濃度<1%,37 ℃缺氧培養(yǎng)3 h后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)[8]。

    1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為6組:(1)正常對(duì)照組:不加任何干預(yù);(2)利拉魯肽對(duì)照組:正常細(xì)胞培養(yǎng)液中加入利拉魯肽25 nmol/L;(3)缺氧高糖模型組:細(xì)胞按“1.3.2”項(xiàng)下方法建立缺氧和高糖模型;(4)利拉魯肽處理組:高糖培養(yǎng)液中加入25 nmol/L的利拉魯肽,再行缺氧過程;(5)GLP-1R抑制劑組:高糖培養(yǎng)液中加入利拉魯肽和exendin (9-39),濃度均為25 nmol/L,再行缺氧過程;(6)高滲對(duì)照組:正常細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為24.5 mmol/L的甘露醇。

    1.3.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定 心肌細(xì)胞按“1.3.3”項(xiàng)下分組處理3 h后,各組加入適量DCFH-DA(10 μmol/L),37 ℃避光孵育30 min。收集細(xì)胞,于熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)480 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)下檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度。

    1.3.5 心肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的測(cè)定 按Fura-2/AM 說明書,將各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后收集細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液,加入溶于DMSO的Fura-2/AM(終濃度為1 μmol/L)。37 ℃恒溫振蕩30 min,負(fù)載后的細(xì)胞用Hanks液離心洗滌后,采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定心肌細(xì)胞胞漿[Ca2+]i。

    1.3.6 心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP酶活性測(cè)定 接種于24孔板的心肌細(xì)胞,按照“1.3.3”項(xiàng)下分組進(jìn)行處理3 h后,收集各組細(xì)胞,試劑盒測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP酶活性,實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.3.7 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)鈣敏感的鈣蛋白酶(μ-calpain)基因表達(dá) 參照Trizol試劑盒的方法提取細(xì)胞總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄酶和Oligo dT引物將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR反應(yīng)。μ-calpain引物:上游:5′-GATGGAAAGCTGGTGTTCGT-3′,下游:5′-AGCTGCTCACGTTCATAGGG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為491 bp。β-actin引物上游:上游:5′-AAAGACCTCTATGCCAAC A-3′,下游:5′-TTGTCA AAGAAAGGGTGTAA-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為301 bp。反應(yīng)條件:94 ℃,5 min;94 ℃,30 s;59 ℃,45 s;72 ℃,50 s;72 ℃,6 min;35個(gè)循環(huán)后轉(zhuǎn)為4 ℃保存。用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)出各擴(kuò)增條帶的光密度值,以同一樣品目的基因擴(kuò)增帶的光密度與β-actin 擴(kuò)增帶的光密度比值計(jì)算出RT-PCR產(chǎn)物的相對(duì)含量。

    1.3.8 細(xì)胞凋亡指數(shù)的測(cè)定 按照Annexin-V-FLUOS Staining KIT使用說明進(jìn)行操作,用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率。

    1.3.9 ELISA 法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中caspase-3活性 細(xì)胞按照“1.3.3”項(xiàng)下分組進(jìn)行處理3 h后,試劑盒測(cè)定心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中caspase-3活性,實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定OD值,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算各樣品的caspase-3水平。

    2 結(jié) 果

    2.1 新生大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)觀察及存活率檢測(cè) 心肌細(xì)胞貼壁3~4 h后,細(xì)胞由圓形變?yōu)椴灰?guī)則狀,約24 h可見心肌細(xì)胞自律搏動(dòng),48 h細(xì)胞呈現(xiàn)為多角形或梭形,3 d后大部分細(xì)胞相互連接,聚集成簇。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示,細(xì)胞成活率為(95±1.02)%,能夠滿足下一步實(shí)驗(yàn)要求。

    2.2 利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞的影響

    2.2.1 對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧族(ROS)和游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響 與正常對(duì)照組相比,缺氧高糖模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平和[Ca2+]i顯著升高(P<0.01),利拉魯肽對(duì)照組和高滲對(duì)照組無顯著變化(P>0.05),提示缺氧和高糖狀態(tài)導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載;與缺氧高糖模型組相比,利拉魯肽處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平和[Ca2+]i顯著降低(P<0.01);與利拉魯肽處理組相比,GLP-1R抑制劑組細(xì)胞內(nèi)ROS水平和[Ca2+]i升高 (P<0.01)。見表1。

    2.2.2 對(duì)心肌細(xì)胞Ca2+-ATP、Na+-K+-ATP酶活性的影響 與正常對(duì)照組相比,缺氧高糖模型組細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性顯著降低(P<0.01),利拉魯肽對(duì)照組和高滲對(duì)照組細(xì)胞無明顯變化(P>0.05);與缺氧高糖模型組相比,利拉魯肽處理組細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性顯著增加(P<0.01);與利拉魯肽處理組相比,GLP-1R抑制劑組細(xì)胞內(nèi)Ca2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性降低(P<0.05)。見表1。

    表1 利拉魯肽對(duì)缺氧高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞ROS和[Ca2+]i的影響 (n=6;±s)

    注:與正常對(duì)照組比較,①P<0.01;與缺氧高糖模型組比較,②P<0.01;與利拉魯肽處理組比較,③P<0.05

    2.2.3 對(duì)心肌細(xì)胞μ-calpain mRNA表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比,缺氧高糖模型組μ-calpain mRNA表達(dá)量顯著增加(P< 0.01);與缺氧高糖模型組相比,利拉魯肽處理組μ-calpain mRNA表達(dá)量明顯降低 (P<0.01);GLP-1R抑制劑exendin(9-39)能抑制利拉魯肽的上述作用(P< 0.05);而利拉魯肽對(duì)照組、高滲對(duì)照組與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05,圖1)。

    2.2.4 對(duì)心肌細(xì)胞caspase-3活性和細(xì)胞凋亡率的影響 與正常對(duì)照組相比,缺氧高糖模型組細(xì)胞caspase-3活性及凋亡率顯著升高(P<0.01),利拉魯肽對(duì)照組和高滲對(duì)照組細(xì)胞無明顯變化(P>0.05);與缺氧高糖模型組相比,利拉魯肽處理組細(xì)胞caspase-3活性及凋亡率顯著降低(P<0.01);與利拉魯肽處理組相比,GLP-1R抑制劑組細(xì)胞caspase-3活性及凋亡率升高(P<0.05,表2)。

    圖1 利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞 μ-calpain mRNA表達(dá)的影響(n=3;

    A.電泳圖;B.數(shù)據(jù)圖。1.正常對(duì)照組;2.缺氧高糖模型組;3.利拉魯肽對(duì)照組;4.利拉魯肽處理組;5.GLP-1R抑制劑組;6.高滲對(duì)照組。與正常對(duì)照組比較,①P<0.01;與缺氧高糖模型組比較,②P<0.01;與利拉魯肽處理組比較,③P<0.05

    表2 利拉魯肽對(duì)缺氧高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞 caspase-3活性和凋亡率的影響 (n=6;

    注:與正常對(duì)照組比較,①P<0.01;與缺氧高糖模型組比較,②P<0.01;與利拉魯肽處理組比較,③P<0.05

    3 討 論

    在糖尿病患者中,高糖和缺氧是臨床常見的心肌損傷因素,心肌缺血等心血管疾病導(dǎo)致的死亡占糖尿病患者死亡的50%以上[9]。因此,本實(shí)驗(yàn)?zāi)M糖尿病病變過程中心肌細(xì)胞的缺氧和高糖狀態(tài),采用原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞作為干預(yù)的靶點(diǎn),對(duì)預(yù)防和延緩糖尿病心肌病具有指導(dǎo)意義。

    在高血糖狀態(tài)下,缺氧和細(xì)胞內(nèi)過多的葡萄糖可通過多種通路致使細(xì)胞損傷[10,11],這些代謝通路均可產(chǎn)生活性氧,大量氧自由基可使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,使細(xì)胞膜通透性增強(qiáng),引起細(xì)胞外鈣離子大量?jī)?nèi)流;并導(dǎo)致膜上Na+-K+-ATP酶失活,鈉鈣交換增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高[12],導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載。鈣離子是胞漿內(nèi)重要的第二信使,是多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的共同交匯點(diǎn),在多途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起中心調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞內(nèi)鈣超載,會(huì)使細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常,進(jìn)一步導(dǎo)致物質(zhì)代謝和能量代謝障礙[11]。本研究發(fā)現(xiàn),在缺氧和高糖的雙重刺激作用下,缺氧高糖模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加,鈣離子濃度急劇升高,Ca2+-ATP和Na+-K+-ATP酶活性顯著降低,提示心肌細(xì)胞在缺氧和高糖雙重刺激下處于鈣超載狀態(tài)。利拉魯肽是一種長(zhǎng)效的GLP-1類似物。近年來,多項(xiàng)基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)證實(shí),利拉魯肽對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用,可縮小心肌梗死范圍,提高小鼠冠狀動(dòng)脈阻塞后存活率[13]。本實(shí)驗(yàn)觀察到利拉魯肽可抑制缺氧和高糖刺激下心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和鈣超載,對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。

    鈣敏感的鈣蛋白酶(calpain)屬于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成員,是一種特殊的蛋白水解酶,其中研究最廣泛的是calpain-1(μ-calpain),在細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子高水平時(shí)被激活。μ-Calpain的激活可引起心肌細(xì)胞凋亡效應(yīng)分子(caspase-3,9,12)的級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14];μ-calpain激活caspase-3,活化的caspase-3水解鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin),使calpain活性增加,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[15]。Carpi等[16]報(bào)道心肌細(xì)胞鈣超載時(shí),線粒體膜電位降低的同時(shí)伴隨著calpain活性的上調(diào)。在半胱氨酸蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中,caspase-3是凋亡途徑下游中進(jìn)行底物酶解的關(guān)鍵蛋白酶,是凋亡的效應(yīng)分子和執(zhí)行者[17]。有研究指出,在缺血心肌組織內(nèi)caspase-3高度表達(dá),而降低caspase-3活性的干預(yù)均可減輕心肌細(xì)胞的凋亡程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,利拉魯肽可通過抑制心肌細(xì)胞μ-calpain基因的表達(dá),降低caspase-3水平,降低細(xì)胞凋亡率。而GLP-1R抑制劑exendin(9-39)可拮抗利拉魯肽的上述作用,由于利拉魯肽通過與廣泛分布于全身多個(gè)器官和組織的GLP-1R結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),提示利拉魯肽抑制心肌細(xì)胞鈣超載和凋亡的機(jī)制可能與GLP-1R通路相關(guān)。

    綜上所述,利拉魯肽能夠降低缺氧和高糖所致的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,抑制鈣超載和μ-calpain基因的上調(diào),降低caspase-3水平和細(xì)胞凋亡率,從而對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

    [1] Gitt A K, Schiele R, Wienbergen H,etal. Intensive treatment of coronary artery disease in diabetic patients in clinical practice: results of the MITRA study [J]. Acta Diabetol, 2003, 40 (suppl 2):s343-s347.

    [2] Thandavarayan R A, Giridharan V V, Watanabe K,etal. Diabetic cardiomyopathy and oxidative stress: role of antioxidants [J]. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem, 2011, 9(4): 225-230.

    [3] Xue W, Liu Y, Zhao J,etal. Activation of HIF-1 by metallothionein contributes to cardiac protection in the diabetic heart [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2012, 302 (12): 2528-2535.

    [4] Stamler J, Vaccaro O, Neaton J D,etal. Diabetes, Other Risk Factors, and 12-Yr Cardiovascular Mortality for Men Screened in the Multiple Risk Factor Intervention Trial[J]. Diabetes Care, 1993, 16(2): 434-444.

    [5] Thom T, Haase N, Rosamond W,etal. Heart disease and stroke statistics-2006 update: a report from the american heart association statistics committee and stroke statistics subcommittee[J]. Circulation,2006,113(6):e85-e151.

    [6] 杜燕京,封宇飛,傅得興.利拉魯肽的藥理及臨床研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志,2010,19(23):2115-2119.

    [7] 李建宇,李靈芝,張永亮,等.蕨麻醇提物對(duì)心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)新藥雜志,2007,16(12):944-946.

    [8] 龔海英,張 嶺,李靈芝,等.蕨麻正丁醇部位對(duì)EAHY926內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用[J]. 武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012,21(6):401-404.

    [9] Weiderpass E, Gridley G, Nyrén O,etal. Cause-specific mortality in a cohort of patients with diabetes mellitus: a population-based study in Sweden[J]. J Clin Epidemiol, 2001, 54(8): 802-809.

    [10] Robertson R P. Chronic oxidative stress as a central mechanism for glucose toxicity in pancreatic islet beta cells in diabetes [J]. J Biol Chem, 2004, 279(41):42351-42354.

    [11] 魏登邦,張寶琛.缺氧引起的自由基增殖及其損傷[J].生物學(xué)通報(bào),2003,38(1):7-10.

    [12] Takahashi H, Tran P O, LeRoy E,etal. D-Glyceraldehyde causes Production of intracellular Peroxide in Pancreatic islets, oxidative stress, and defective beta cell function via non-mitochondrial Pathways [J]. J Biol Chem, 2004, 279(16): 37316-37323.

    [13] Haluzík M, Trachta P, Mráz M. Cardiovascular effects of GLP-1 receptor agonist treatment: focus on liraglutide [J]. Vnitr Lek, 2015, 61(7-8):635-640.

    [14] Muhammad M H, Jason R R. Mechanism of pyrethroid pesticide-induced apoptosis: role of calpain and the ER stress pathway [J]. Toxicol Sci, 2011, 122(2):512-525.

    [15] 陳運(yùn)清,王 琳,蘇陶涼,等.風(fēng)濕性心房顫動(dòng)患者calpain-Ⅰ/calpastatin和caspase-3與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及其作用[J].中華心血管病雜志,2006,34(4):303-307.

    [16] Carpi A, Venerando R, Miotto G,etal. Calpain and mitochondrial dysfunction in Ca2+overloaded cardiomyocytes [J]. J Mol Cell Cardiol, 2007, 42(6):S105.

    [17] Nehra S, Bhardwaj V, Saraswat D. Amlodipine protects rat ventricular cardiomyoblast H9c2 From hypoxia-induced apoptosis and restores oxidative balance by Akt-1-dependent manner [J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2014, 64(4):375-384.

    (2016-11-08收稿 2017-04-15修回)

    (責(zé)任編輯 梁秋野)

    Effects and possible mechanism of liraglutide on hypoxia and high glucose-induced calcium overload and apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes in vitro

    LI Yinke, SHI Qiongzhi, CHEN Chen, LIAO Xiangru, and XIE Xiangyang.

    Department of Pharmacy, Wuhan General Hospital of the Chinese People’s Liberation Army, Wuhan 430070, China

    Objective To investigate the effect and possible mechanism of liraglutide on hypoxia and high glucose-induced calcium overload and apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes in vitro.Methods A model of hypoxia and high glucose was established using primarily cultured neonatal rat cardiomyocytes. Then, cells were divided into six groups: normal control group, liraglutide control group, hypoxia and high glucose model group, liraglutide treatment group, GLP-1R antagonist group, and high osmolality control group. The concentration of intracellular dissociative calcium in myocardial cells was determined with fluorospectrophotometry. The levels of Ca2+-ATPase, Na+-K+-ATPase and ROS were measured with biochemical approaches. The apoptosis rate was observed by a flow cytometer. The level of μ-calpain mRNA was examined with RT-PCR method. The level of caspase-3 was measured with ELISA.Results Compared with normal control group, the levels of expression of ROS, caspase-3, and μ-calpain mRNA were significantly increased in hypoxia and high glucose model group (P<0.01), the activity of Ca2+-ATPase and Na+-K+-ATPase decreased (P<0.01), the concentration of free Ca2+increased from 117.19±15.04 nmol/L to 508.53±26.11 nmol/L, and the apoptosis rate increased from (3.95±0.12)% to (31.03±4.30)%. Liraglutide improved the parameters mentioned above (P<0.01). However, exendin(9-39), an antagonist of GLP-1R, attenuated the protective effect of liraglutide under hypoxia and high glucose.Conclusions Liraglutide can obviously inhibit calcium influx of myocardial cells and μ-calpain up-regulation, and decrease the level of caspase-3 and cell apoptosis.

    liraglutide; cardiomyocyte; hypoxia; high glucose; calcium overload; apoptosis

    醫(yī)學(xué)期刊常用字詞正誤對(duì)照表

    湖北省知識(shí)創(chuàng)新專項(xiàng)(自然科學(xué)基金)(2016CFB198),湖北省衛(wèi)計(jì)委科研基金(WJ2017Q031)

    李銀科,碩士,主管藥師。

    430070,解放軍武漢總醫(yī)院藥劑科

    謝向陽,E-mail:xxy5727035@163.com

    R966

    猜你喜歡
    鈣超載利拉魯高糖
    利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍治療2型糖尿病的療效及對(duì)血糖水平的影響
    三七總皂苷對(duì)大鼠急性重癥胰腺炎鈣超載中CaMKⅡ-γ表達(dá)的影響
    黃葵膠囊聯(lián)合利拉魯肽對(duì)早期糖尿病腎病患者的臨床療效
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:00
    葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:04
    丹紅注射液對(duì)高糖引起腹膜間皮細(xì)胞損傷的作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:21
    栝樓桂枝湯治療缺血性腦卒中研究進(jìn)展
    利拉魯肽治療肥胖型2型糖尿病療效觀察
    利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍治療肥胖2型糖尿病17例臨床療效觀察
    張掖市甜菜高產(chǎn)高糖栽培技術(shù)
    缺血性腦損傷與瞬時(shí)受體電位M通道的研究進(jìn)展
    乱码一卡2卡4卡精品| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产黄频视频在线观看| 欧美+日韩+精品| 日韩一区二区三区影片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 午夜视频国产福利| 国产精品一区www在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 免费观看av网站的网址| 男女那种视频在线观看| 美女内射精品一级片tv| 亚洲熟女精品中文字幕| 少妇高潮的动态图| 亚洲精品一区蜜桃| 我的女老师完整版在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久久午夜欧美精品| 伦精品一区二区三区| 熟女人妻精品中文字幕| 舔av片在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 女人久久www免费人成看片| 熟妇人妻不卡中文字幕| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲国产精品成人综合色| 97超视频在线观看视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 日本欧美国产在线视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲久久久久久中文字幕| av一本久久久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 在线免费观看不下载黄p国产| 噜噜噜噜噜久久久久久91| av国产免费在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 黄色一级大片看看| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产成人福利小说| 久久99蜜桃精品久久| 天天一区二区日本电影三级| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 97热精品久久久久久| 国产精品人妻久久久影院| 男人舔奶头视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲国产av新网站| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲国产精品国产精品| 97精品久久久久久久久久精品| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 深夜a级毛片| 午夜福利网站1000一区二区三区| 免费看光身美女| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品人妻熟女av久视频| 听说在线观看完整版免费高清| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产免费福利视频在线观看| 国产欧美亚洲国产| 秋霞伦理黄片| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产成人aa在线观看| av一本久久久久| 国产真实伦视频高清在线观看| 插逼视频在线观看| 免费av观看视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 成人亚洲精品av一区二区| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美一区二区亚洲| 美女国产视频在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 久久久成人免费电影| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲精品国产成人久久av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 在线观看三级黄色| 神马国产精品三级电影在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 中文字幕久久专区| 久久久久久久国产电影| 人妻少妇偷人精品九色| 69人妻影院| 2018国产大陆天天弄谢| 少妇被粗大猛烈的视频| 大话2 男鬼变身卡| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 中文在线观看免费www的网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 老女人水多毛片| 国产精品国产三级国产专区5o| 丰满少妇做爰视频| 18禁在线播放成人免费| 777米奇影视久久| 久久久久精品久久久久真实原创| 成人毛片a级毛片在线播放| av.在线天堂| av福利片在线观看| 看十八女毛片水多多多| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 成人一区二区视频在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 日本三级黄在线观看| 如何舔出高潮| 一级av片app| 久久99热6这里只有精品| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲国产色片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产免费视频播放在线视频| 一级毛片久久久久久久久女| 一级毛片电影观看| 亚洲国产欧美人成| 国产伦精品一区二区三区视频9| 免费观看a级毛片全部| av国产免费在线观看| 七月丁香在线播放| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 中文资源天堂在线| 亚洲不卡免费看| 一级黄片播放器| 插阴视频在线观看视频| av一本久久久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久鲁丝午夜福利片| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 丰满乱子伦码专区| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 深夜a级毛片| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 看免费成人av毛片| 在线播放无遮挡| 欧美一级a爱片免费观看看| 在线观看人妻少妇| 97在线人人人人妻| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品伦人一区二区| 久久精品夜色国产| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲最大成人手机在线| 免费观看的影片在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 一区二区三区乱码不卡18| 国精品久久久久久国模美| 日韩成人av中文字幕在线观看| 婷婷色综合www| 69人妻影院| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产一区亚洲一区在线观看| 免费av毛片视频| 精品一区二区免费观看| 久久精品国产自在天天线| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲天堂av无毛| 成人国产麻豆网| 亚洲怡红院男人天堂| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲伊人久久精品综合| 日日撸夜夜添| 一级毛片电影观看| 一级毛片电影观看| 久久久久久国产a免费观看| 777米奇影视久久| 国产成人免费观看mmmm| 美女国产视频在线观看| 精品一区二区免费观看| 精品国产三级普通话版| 搡女人真爽免费视频火全软件| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 七月丁香在线播放| 我的女老师完整版在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 99久久精品热视频| 大片电影免费在线观看免费| 超碰av人人做人人爽久久| 色视频在线一区二区三区| 久久97久久精品| 欧美激情在线99| 插阴视频在线观看视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲人成网站在线播| 中文在线观看免费www的网站| tube8黄色片| 免费人成在线观看视频色| 97超碰精品成人国产| 亚洲经典国产精华液单| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久久久久九九精品二区国产| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 99re6热这里在线精品视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 欧美日韩综合久久久久久| 22中文网久久字幕| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 精品午夜福利在线看| 精品一区在线观看国产| 超碰av人人做人人爽久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 99热6这里只有精品| 99久久人妻综合| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产探花极品一区二区| 一个人看的www免费观看视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久99蜜桃精品久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久久久久久精品精品| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久精品性色| 国产精品伦人一区二区| 亚洲图色成人| 青春草视频在线免费观看| 亚洲在久久综合| 国产免费福利视频在线观看| 国产 一区精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 观看美女的网站| 一级毛片我不卡| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品一二三区在线看| 亚洲人成网站在线观看播放| 日本一二三区视频观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 黄色日韩在线| 白带黄色成豆腐渣| 搞女人的毛片| 国产免费福利视频在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲精品,欧美精品| av国产免费在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 九色成人免费人妻av| 国产综合精华液| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 美女主播在线视频| 精品午夜福利在线看| 国产视频首页在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 久久久久精品性色| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品少妇久久久久久888优播| 免费观看性生交大片5| 好男人视频免费观看在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人无遮挡网站| 六月丁香七月| 日韩欧美精品免费久久| 久久精品夜色国产| 最近的中文字幕免费完整| 成年av动漫网址| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 日韩av免费高清视频| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲国产精品专区欧美| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产av码专区亚洲av| 国产成人freesex在线| 欧美三级亚洲精品| 九九在线视频观看精品| 国产精品一区二区在线观看99| 成人毛片a级毛片在线播放| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 又爽又黄a免费视频| 九九爱精品视频在线观看| av黄色大香蕉| 又爽又黄a免费视频| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 丝袜喷水一区| 成人欧美大片| 观看免费一级毛片| 免费黄网站久久成人精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲av不卡在线观看| 又爽又黄a免费视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 成人欧美大片| 美女被艹到高潮喷水动态| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 尾随美女入室| 久久97久久精品| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 美女内射精品一级片tv| 丝袜美腿在线中文| 在现免费观看毛片| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 久热久热在线精品观看| 秋霞在线观看毛片| 免费黄网站久久成人精品| 内地一区二区视频在线| 91狼人影院| 伦精品一区二区三区| 五月开心婷婷网| 男人舔奶头视频| 国产黄色免费在线视频| 一级毛片 在线播放| 综合色av麻豆| 91久久精品国产一区二区三区| 听说在线观看完整版免费高清| 超碰av人人做人人爽久久| 毛片女人毛片| 成年免费大片在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲国产高清在线一区二区三| 成人国产麻豆网| xxx大片免费视频| 婷婷色综合www| 久热久热在线精品观看| 伦精品一区二区三区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国国产精品蜜臀av免费| 嫩草影院入口| 丝袜脚勾引网站| 成年免费大片在线观看| 秋霞伦理黄片| 黄色日韩在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产成人精品一,二区| 搞女人的毛片| 街头女战士在线观看网站| 激情五月婷婷亚洲| 欧美丝袜亚洲另类| 国产免费又黄又爽又色| 欧美激情国产日韩精品一区| 午夜福利在线在线| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品久久久久久av不卡| 色视频www国产| 免费av观看视频| 全区人妻精品视频| 久久久久久伊人网av| 色视频在线一区二区三区| 婷婷色av中文字幕| 亚洲在线观看片| 久久久久久久久久人人人人人人| 男女啪啪激烈高潮av片| 有码 亚洲区| 最近的中文字幕免费完整| 成年版毛片免费区| 国产成人精品久久久久久| 七月丁香在线播放| 大片电影免费在线观看免费| av女优亚洲男人天堂| 在线观看人妻少妇| 搞女人的毛片| 免费看a级黄色片| 2018国产大陆天天弄谢| 国产亚洲av嫩草精品影院| 成年人午夜在线观看视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 99精国产麻豆久久婷婷| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 人妻系列 视频| 日韩视频在线欧美| 三级经典国产精品| 永久网站在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产 一区精品| 中国三级夫妇交换| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久久精品性色| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美人与善性xxx| 欧美精品一区二区大全| 国产成年人精品一区二区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 丝瓜视频免费看黄片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 成人无遮挡网站| 久久精品国产亚洲网站| 久久亚洲国产成人精品v| 1000部很黄的大片| 丰满乱子伦码专区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 精品人妻熟女av久视频| 免费av观看视频| 制服丝袜香蕉在线| 一级a做视频免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 在线观看人妻少妇| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩三级伦理在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 99热这里只有是精品50| 日韩国内少妇激情av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美zozozo另类| 亚洲天堂国产精品一区在线| 搞女人的毛片| 亚洲av.av天堂| 最后的刺客免费高清国语| 精品久久久噜噜| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩一本色道免费dvd| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲精品国产av成人精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 麻豆久久精品国产亚洲av| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品99久久99久久久不卡 | .国产精品久久| 日韩人妻高清精品专区| 在线观看国产h片| 日韩免费高清中文字幕av| 国产色婷婷99| 亚洲色图av天堂| 又大又黄又爽视频免费| 美女cb高潮喷水在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 最近手机中文字幕大全| 老女人水多毛片| 国产黄色免费在线视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最后的刺客免费高清国语| av专区在线播放| 少妇人妻 视频| 激情 狠狠 欧美| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产免费一级a男人的天堂| 久久久久久伊人网av| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲人成网站高清观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一区二区av电影网| 观看美女的网站| 99久久人妻综合| 成人亚洲精品一区在线观看 | 三级国产精品片| 男女那种视频在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产日韩欧美在线精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 日本av手机在线免费观看| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久久久久久久久免费av| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 我的女老师完整版在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| av在线app专区| .国产精品久久| www.色视频.com| 国产亚洲一区二区精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 国产免费一区二区三区四区乱码| 女人被狂操c到高潮| 内射极品少妇av片p| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产成年人精品一区二区| 97超视频在线观看视频| 97超视频在线观看视频| 亚洲国产欧美在线一区| 精品午夜福利在线看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 九九爱精品视频在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 一级毛片 在线播放| 午夜老司机福利剧场| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产成人freesex在线| 国产 一区精品| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 男女下面进入的视频免费午夜| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产色爽女视频免费观看| 日本色播在线视频| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲av不卡在线观看| 伦精品一区二区三区| 国产成人精品婷婷| 麻豆乱淫一区二区| 女人久久www免费人成看片| 高清av免费在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久久久久久久久成人| 日本色播在线视频| 97精品久久久久久久久久精品| 尾随美女入室| 成人国产麻豆网| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产毛片a区久久久久| 色吧在线观看| 51国产日韩欧美| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 精品久久国产蜜桃| 免费在线观看成人毛片| 免费av不卡在线播放| 亚洲国产欧美在线一区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产免费一级a男人的天堂| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 免费黄网站久久成人精品| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲,一卡二卡三卡| 乱码一卡2卡4卡精品| 3wmmmm亚洲av在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 色综合色国产| tube8黄色片| 日韩av不卡免费在线播放| 国产高清有码在线观看视频| 又爽又黄a免费视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久精品综合一区二区三区| 天堂俺去俺来也www色官网| h日本视频在线播放| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产淫片久久久久久久久| 在线播放无遮挡| 成人黄色视频免费在线看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 日韩视频在线欧美| 国产黄片美女视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 在线 av 中文字幕| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 欧美bdsm另类| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲精品一二三| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品国产三级国产专区5o| 少妇高潮的动态图| 欧美精品国产亚洲| 日韩亚洲欧美综合| 特级一级黄色大片| 亚洲av成人精品一二三区| 下体分泌物呈黄色| 内射极品少妇av片p| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日韩亚洲欧美综合| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 一边亲一边摸免费视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 大话2 男鬼变身卡| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 九九在线视频观看精品| 我要看日韩黄色一级片| 精品一区二区三卡| 日韩中字成人| 国产精品99久久99久久久不卡 | 91久久精品国产一区二区三区| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产男女超爽视频在线观看| 精品久久久久久久末码| 一个人看的www免费观看视频| 天天躁日日操中文字幕| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 色播亚洲综合网| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产精品偷伦视频观看了| 嫩草影院入口| 国产又色又爽无遮挡免| 精品一区二区免费观看| 99热6这里只有精品| 国产黄片美女视频| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 色播亚洲综合网| 尾随美女入室| 观看美女的网站| 日韩电影二区| 有码 亚洲区| 日日啪夜夜爽| 爱豆传媒免费全集在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 你懂的网址亚洲精品在线观看|