羊種布魯氏菌Rev.1突變株在BALB/c鼠中的免疫保護(hù)評(píng)價(jià)

葉 鋒，馬曉菁，劉麗婭，谷文喜，吐?tīng)柡椤づ瑺?，易新萍，馬俊杰，鐘 旗

（新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

羊種布魯氏菌Rev.1突變株在BALB/c鼠中的免疫保護(hù)評(píng)價(jià)

葉 鋒，馬曉菁，劉麗婭，谷文喜，吐?tīng)柡椤づ瑺?，易新萍，馬俊杰，鐘 旗

（新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

為評(píng)價(jià)Rev.1-ΔKan-VirB12突變株在BALB/c鼠中的免疫保護(hù)力，以Rev.1為參照，用Rev.1-ΔKan-VirB12接種BALB/c小鼠，免疫45 d后用布魯氏菌16M強(qiáng)毒株攻毒，15 d后取BALB/c鼠脾臟進(jìn)行克脾指數(shù)測(cè)定和病理組織學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示：BALB/c鼠免疫攻毒15 d后，Rev.1-ΔKan-VirB12免疫組和Rev.1免疫組的克脾指數(shù)與對(duì)照組之間有顯著性差異（P＜0.05），而Rev.1免疫組與Rev.1-ΔKan-VirB12免疫組之間的克脾指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，羊布魯氏菌Rev.1-ΔKan-VirB12突變株與其親本Rev.1株的免疫保護(hù)性無(wú)明顯差異，具備作為布魯氏菌病標(biāo)記疫苗的潛力。

羊種布魯氏菌；Rev.1；突變株；免疫保護(hù)

布魯氏菌病（以下簡(jiǎn)稱布?。┦怯刹剪斒暇˙rucella）引起的一種人獸共患傳染病[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外布魯氏菌病疫情呈上升趨勢(shì)，引起了廣泛關(guān)注。人主要通過(guò)直接或間接接觸患病動(dòng)物而感染布病。研究表明目前感染人最多的是羊種布魯氏菌[2-3]。在切斷傳染源的基礎(chǔ)上，疫苗接種是公認(rèn)的能夠降低畜間布病發(fā)病率的有效方法之一[4]。因此，布病疫苗的研制一直是布病防控的主要研究熱點(diǎn)。

布魯氏菌為胞內(nèi)寄生菌，抗生素對(duì)其效果甚微。機(jī)體的細(xì)胞免疫對(duì)抑制布病有至關(guān)重要的作用[5]。目前布病疫苗中弱毒活疫苗的應(yīng)用最為廣泛。用于羊布病免疫的疫苗主要包括Rev.1、M5和S2，其為過(guò)去幾十年的布病防疫提供了重要保障，但也存在毒力較強(qiáng)，可引起負(fù)反應(yīng)，且無(wú)法區(qū)分疫苗免疫和自然感染等問(wèn)題。目前有國(guó)外研究機(jī)構(gòu)使用Rev.1結(jié)膜免疫3~4個(gè)月后，通過(guò)檢測(cè)抗體是否存在，來(lái)鑒別疫苗免疫和自然感染。但該方法的免疫過(guò)程較為繁瑣，也存在將疫苗灑落到飼養(yǎng)環(huán)境中造成污染的風(fēng)險(xiǎn)，且因個(gè)體差異等因素，其鑒別診斷結(jié)果存在較大差異。為了解決當(dāng)前疫苗使用中存在的這些問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)布魯氏菌進(jìn)行了遺傳改造，從而獲得具有分子標(biāo)記的疫苗株[6-10]。研究表明，IV 型分泌系統(tǒng)中的VirB12蛋白可以作為一種布病血清學(xué)的檢測(cè)抗原[11]。本研究應(yīng)用同源重組的方法，將VirB12基因替換為Kana基因，獲得了Rev.1-ΔKan-VirB12突變株，并在小動(dòng)物模型上驗(yàn)證了其安全性和免疫效果，為布病防治提供了技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Brucella Broth培養(yǎng)基和Brucella Agar培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)BD公司；布魯氏菌抗原，購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病研究所；氨芐青霉素、卡那霉素，購(gòu)自Sigma公司。

1.2 菌株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

標(biāo)準(zhǔn)菌株16M、Rev.1，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；Rev.1-ΔKan-VirB12突變株，由本室構(gòu)建并保存；6周齡左右SPF級(jí)BALB/c小鼠，體重（18.5±1.5）g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SCXK（新）2003-0002。BALB/c鼠飼養(yǎng)及解剖場(chǎng)地為新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司P3動(dòng)物房。

1.3 菌懸液制備及毒力測(cè)定

將羊種16M毒株劃線接種于TS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)3 d；挑取單菌落接種于100 mL TS液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)2~3 d，觀察菌的濃度；將菌液分別進(jìn)行稀釋，并根據(jù)不同梯度稀釋后，將菌液涂布于布氏瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)3~5 d后計(jì)數(shù)備用。將16M菌株以1.0×109CFU腹股溝注射BALB/c鼠，15 d后取脾臟研磨分菌，并計(jì)算其克脾菌數(shù)。

1.4 16M毒株感染BALB/c鼠的劑量確定

將BALB/c鼠在隔離籠具中飼養(yǎng)3 d，使其適應(yīng)環(huán)境。將16M標(biāo)準(zhǔn)毒株按照1.0×102~1.0×107CFU/只的劑量，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組注射同等劑量PBS。15 d采血后剖檢；脾臟加入1.0 mL TS液研磨成勻漿；將勻漿10倍稀釋后取100 μL涂布于TSA平板上進(jìn)行分菌計(jì)數(shù)；37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱放置3~5 d后進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定16M的感染劑量。

1.5 Rev.1、Rev.1-ΔKan-VirB12突變株抗體消長(zhǎng)測(cè)定

取50只6周齡的雌性BALB/c小鼠，體重（18.5±1.5）g；隨機(jī)將小鼠分成Rev.1組、Rev.1-ΔKan-VirB12組，每組各25只小鼠；分別腹腔注射免疫接種Rev.1疫苗株和Rev.1-ΔKan-VirB12株；免疫后每隔1周進(jìn)行眼球采血，持續(xù)7周，每次每組3只BALB/c小鼠；采用SAT進(jìn)行抗體檢測(cè)，繪制抗體消長(zhǎng)趨勢(shì)圖。

1.6 BALB/c小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)

取100只6周齡的雌性BALB/c小鼠，體重（18.5±1.5）g；隨機(jī)分成Rev.1組、Rev.1-ΔKan-VirB12組，每組各40只，PBS對(duì)照組20只；分別以3.0×104CFU劑量經(jīng)腹腔注射免疫接種Rev.1和Rev.1-ΔKan-VirB12株，空白組注射同等劑量PBS；免疫后每周每組取5只（PBS組取3只）采血，分離血清做后抗體檢測(cè)；剖殺取脾臟稱重，研磨成勻漿后分菌計(jì)數(shù)；免疫后45 d，用16M強(qiáng)毒株以3.0×104CFU劑量腹腔注射攻毒所有BALB/c小鼠；在攻毒15 d、30 d后采血，分離血清；剖殺小鼠，將脾臟稱重后，研磨成勻漿進(jìn)行分菌計(jì)數(shù)。對(duì)脾臟稱重及菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行方差檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 BALB/c鼠免疫攻毒組織器官病理變化

免疫攻毒后15 d剖殺BALB/c鼠，用多聚甲醛固定PBS對(duì)照組、Rev.1株組、Rev.1-ΔKan-VirB12突變株組BALB/c鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織，然后制成石蠟切片，HE染色后鏡檢，觀察BALB/c鼠臟器組織病理變化。

2 結(jié)果

2.1 16M毒力測(cè)定

16M攻毒小鼠后，取脾臟研磨鋪板培養(yǎng)計(jì)數(shù)，計(jì)算出的克脾菌數(shù)為2.3×106CFU/g，表明該16M株為強(qiáng)度株。

2.2 16M感染BALB/c鼠劑量測(cè)定

根據(jù)表1可知，將16M以1.0×104CFU劑量感染BALB/c鼠，15 d后血清中可檢測(cè)到布病抗體，BALB/c鼠脾臟中也可分到布魯氏菌，其克脾指數(shù)（log CFU/g）與1.0×105CFU劑量感染BALB/c鼠值接近，說(shuō)明16M株攻毒BALB/c鼠的最小攻毒劑量為1.0×104CFU。因此，確定本研究中16M強(qiáng)毒株攻毒BALB/c鼠的攻毒劑量為3.0×104CFU。

表1 羊種16M強(qiáng)毒株感染BABL/c鼠劑量確定

2.3 Rev.1和Rev.1-ΔKan-VirB12抗體消長(zhǎng)趨勢(shì)

如圖1所示，Rev.1和Rev.1-ΔKan-VirB12免疫BALB/c鼠均能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，Rev.1與Rev.1-ΔKan-VirB12免疫抗體在BALB/c鼠內(nèi)消長(zhǎng)曲線趨向基本一致，并沒(méi)有明顯的差異；在第2周即可檢測(cè)到血清學(xué)抗體，第3~4周抗體滴度維持在較高水平，此后抗體滴度開(kāi)始下降，第6~7周抗體水平低于1:25或基本檢測(cè)不到。

圖1 布魯氏菌Rev.1-ΔKan-VirB12免疫抗體消長(zhǎng)曲線

2.4 BALB/c小鼠免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

分析結(jié)果表明，Rev.1免疫攻毒組與Rev.1-ΔKan-VirB12免疫攻毒組之間的克脾指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。Rev.1免疫攻毒組、Rev.1-ΔKan-VirB12免疫攻毒組和PBS對(duì)照攻毒組之間的克脾指數(shù)差異顯著（P＜0.05）。Rev.1組（n=20）有4只BALB/c鼠的脾臟分離出布魯氏菌；Rev.1-ΔVirB12組（n=20）有3只BALB/c鼠的脾臟分離出布魯氏菌；PBS對(duì)照攻毒組（n=20）中的所有20只BALB/c鼠均分離出布魯氏菌。攻毒后30 d，Rev.1和Rev.1-ΔKan-VirB12免疫攻毒組與PBS對(duì)照攻毒組的克脾指數(shù)趨于一致。該結(jié)果表明，Rev.1-ΔKan-VirB12與Rev.1株對(duì)布魯氏菌16M毒株均有較好的保護(hù)抵抗力，Rev.1-ΔKan-VirB12株的免疫保護(hù)力與Rev.1株相當(dāng)（表2）。

表2 BALB/c鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 BALB/c小鼠脾臟形態(tài)觀察

小鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)布魯氏菌的毒力殘留已成為一種國(guó)際通用的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[12]。本研究結(jié)果表明，在用Rev.1疫苗株、Rev.1-ΔKan-VirB12株免疫BALB/c鼠45 d后，用16M攻毒，小鼠脾臟炎癥反應(yīng)與疫苗免疫的保護(hù)力呈正相關(guān)性。由圖2可以看出，免疫攻毒15 d后，PBS攻毒對(duì)照組的小鼠脾臟比Rev.1-ΔKan-VirB12組、Rev.1組和空白組的明顯腫大。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在免疫攻毒30 d后，與PBS對(duì)照攻毒組相比，免疫Rev.1組和Rev.1-ΔKan-VirB12組的小鼠脾臟發(fā)生輕微腫大，其炎癥反應(yīng)基本與空白組趨于一致。

圖2 BALB/c小鼠脾臟形態(tài)變化

2.6 組織病理變化

與PBS攻毒對(duì)照組相比較，病理組織學(xué)切片結(jié)果表明，Rev.1、Rev.1-ΔKan-VirB12免疫攻毒組BALB/c鼠的心臟、肺臟和腎臟組織中均未見(jiàn)明顯病理變化，而非免疫攻毒組BALB/c鼠的心臟、肺臟、肝臟和脾臟卻有明顯的病理變化。Rev.1免疫攻毒組BALB/c鼠脾臟組織出現(xiàn)輕微的增寬現(xiàn)象，以及脾小梁延伸、紅髓與白髓界限不清、肝細(xì)胞充血出血；Rev.1-ΔKan-VirB12免疫攻毒組BALB/c鼠脾臟出現(xiàn)輕微的增寬現(xiàn)象及脾小梁延伸，肝細(xì)胞出血、輕度水腫；PBS對(duì)照攻毒組脾竇擴(kuò)張充血明顯，白髓稍減少，部分區(qū)域肝細(xì)胞有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。（圖3、圖4）。

圖3 16M毒株攻毒BALB/c鼠的脾臟病理組織切片（HE×100）

圖4 16M毒株攻毒BALB/c鼠的肝臟病理組織切片（HE×100）

3 討論

目前，畜間布病的防治主要依賴疫苗接種，M5、S2和Rev.1均可用于羊布病的免疫。本研究以Rev.1為親本株，利用同源重組技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改造，以Kana基因替代了布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS）中VirB12基因，獲得了具有布病診斷標(biāo)記的Rev.1-ΔKan-VirB12標(biāo)記疫苗株，為建立區(qū)分動(dòng)物布病免疫和自然感染的鑒別診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

Ⅳ型分泌系統(tǒng)（T4SS） 是布魯氏菌的關(guān)鍵致病力因子，由12個(gè)可跨膜蛋白的多蛋白復(fù)合物家族組成，與布魯氏菌細(xì)胞內(nèi)生存繁殖有關(guān)[13-14]。研究證明，VirB12在布魯氏菌感染中是一種免疫原性蛋白，但卻不是T4SS系統(tǒng)的必需蛋白[15]。根據(jù)文獻(xiàn)記載，機(jī)體對(duì)抗布魯氏菌的主要是細(xì)胞免疫[16-18]。本研究以Rev.1疫苗株為參照，用Rev.1-ΔKan-VirB12突變株免疫BALB/c鼠，檢測(cè)結(jié)果表明，Rev.1-ΔKan-VirB12突變株和Rev.1株在BALB/c 鼠體內(nèi)都可產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其抗體強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間保持一致，即免疫后的3~4周達(dá)到頂峰，6周后抗體滴度基本低于1:25。為了評(píng)價(jià)突變株的免疫保護(hù)力，本研究在免疫45 d后對(duì)小鼠進(jìn)行16M攻毒試驗(yàn)，剖檢后取臟器進(jìn)行評(píng)價(jià)。從克脾指數(shù)上看，突變株與Rev.1株無(wú)顯著差異（P>0.05），而PBS對(duì)照組則與以上兩組有顯著差異（P<0.05）。從脾臟和肝臟的病理組織切片也可以看出，Rev.1-ΔKan-VirB12突變株和Rev.1株對(duì)16M均具有較好的保護(hù)抵抗力，且其免疫保護(hù)力也基本保持一致。

綜上所述，本研究對(duì)Rev.1-ΔKan-VirB12在BALB/c鼠體內(nèi)的毒力、抗體水平、對(duì)臟器的影響及對(duì)強(qiáng)度株的免疫保護(hù)效力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，與親本株相比，Rev.1-ΔKan-VirB12突變株在BALB/c鼠體內(nèi)毒力有所降低，但免疫保護(hù)效力無(wú)顯著差異。本研究為布魯氏菌標(biāo)記疫苗的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)，但相關(guān)的鑒別診斷方法和突變株對(duì)靶動(dòng)物的免疫效力還需進(jìn)一步建立及驗(yàn)證。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Evaluation of Protective Eff i cacy about Brucella melitensis Rev.1 Mutant in BALB/c Mice

Ye Feng，Ma Xiaojing，Liu Liya，Gu Wenxi，Tuerhong·Nuer，Yi Xinping，Ma Junjie，Zhong Qi
（Institute of Veterinary Research，Xinjiang Academy of Animal science，Urumuqi，Xinjiang 830000）

In order to evaluate protective efficacy of Rev.1-ΔKan-VirB12 mutant in BALB/c mice，BALB/c mice were vaccinated with both Rev.1 and Rev.1-ΔKan-VirB12，and then were challenged with 16M after vaccinated 45 d. Fifteen days post challenge，the spleens of BALB/c mice were taken for theBrucellaload of gram of spleen determination and histopathological examination. Results showed that there was signif i cant difference between Rev.1-ΔKan-VirB12 group and Rev.1 group and control group（P<0.05）. The difference ofBrucellaload of gram of spleen between Rev.1 immune group andKan-VirB12 immune group was not signif i cant（P>0.05）. The results showed that the protective eff i cacy of both was nearly same，holding the potential as a vaccine for Brucellosis.

Brucella.melitensis；Rev.1；mutant；protective eff i cacy

S851.3

：B

：1005-944X（2017）07-0100-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.028

新疆高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（201311102）；新疆公益性科研院所基金（KYGY2016020）

鐘 旗