北冬蟲夏草副產(chǎn)物功能因子提取工藝研究

張斌，劉博華，溫祿云

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

北冬蟲夏草副產(chǎn)物功能因子提取工藝研究

張斌，劉博華，溫祿云

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

北冬蟲夏草副產(chǎn)物為成熟子實(shí)體采摘后的培養(yǎng)基殘基、菌絲體殘?bào)w，主要活性成分與子實(shí)體相近，為蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素、腺苷類及蛋白質(zhì)等。采用雙頻超聲波輔助提取技術(shù)、酶工程技術(shù)，對(duì)北冬蟲夏草副產(chǎn)物中的蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸、多肽等功能因子進(jìn)行提取。干燥提取物中多糖含量25.4%、蟲草素含量0.6%、蟲草酸含量5.2%、多肽含量23.7%。

北冬蟲夏草副產(chǎn)物；雙頻超聲波；酶工程

北冬蟲夏草又名北冬蟲夏草、北蟲草、蟲草花，拉丁學(xué)名為Cordycepsmilitaris，野生北冬蟲夏草是一種寄生于鱗翅目和鞘翅目昆蟲蛹提上的大型真菌，與傳統(tǒng)中藥材冬蟲夏草（Cordycepssinensis）同屬于子囊菌亞門，麥角菌目，蟲草菌屬[1]。北冬蟲草天然資源的世界性分布數(shù)量很少，由子座（草的部分）、核菌（蟲的尸體部分）組成，多以蛾蛹或蠶蛹為寄主[2]。既是一種珍稀的食用菌，又是一種珍貴的中藥材。2009年，經(jīng)中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)，北冬蟲夏草可以作為新資源食品，可直接食用，也可作為食品原料，在酒類、罐頭、調(diào)味品、飲料中應(yīng)用[3]，這為北冬蟲夏草資源的開發(fā)和利用起到了十分積極的作用。

1986年吉林省蠶業(yè)通過在家蠶和昨蠶上培養(yǎng)北蟲草成功獲得子實(shí)體[4]。90年代后，以大米培養(yǎng)基為主的固態(tài)培養(yǎng)基栽培法逐漸普及，這也是目前北冬蟲夏草最主要的人工培養(yǎng)方式。收獲北冬蟲夏草子實(shí)體后，培養(yǎng)基殘基通常被作為廢棄物處理，據(jù)統(tǒng)計(jì)可知栽培時(shí)北蟲草子實(shí)體干重與蟲草基干重之比為1∶3或1∶4，廢棄培養(yǎng)基勢(shì)必造成資源的極大浪費(fèi)，堆積后發(fā)酸發(fā)臭對(duì)環(huán)境也產(chǎn)生一定的影響。隨著北蟲草栽培產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，對(duì)北蟲草固體培養(yǎng)殘基如何進(jìn)行產(chǎn)品加工開發(fā)、對(duì)活性成分的提取利用己成為迫切需要解決的問題。培養(yǎng)基殘基中仍含有部分蟲草子實(shí)體和大量菌絲體，目前己有利用北蟲草培養(yǎng)基殘基釀制功能型醋[5]、功能型保健醬油[6]等報(bào)道，但總體來說，剩余基質(zhì)的利用率仍然較低。

經(jīng)檢測，北蟲草培養(yǎng)基殘基中的營養(yǎng)成分與功能因子種類與子實(shí)體一致，均含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖等[7]（見表1），雖含量較低，但其數(shù)量巨大，價(jià)格低廉，來源豐富，因此從剩余基質(zhì)中提取營養(yǎng)物質(zhì)和功能因子，具有一定的研究價(jià)值。

表1 北冬蟲夏草副產(chǎn)物中主要營養(yǎng)物質(zhì)的含量對(duì)比Table 1 The content of main nutrients of Cordycepsmilitaris by-products

1 材料與方法

1.1 材料

人工培養(yǎng)北冬蟲夏草采收后的培養(yǎng)基殘基：天津東方中濱農(nóng)業(yè)科技有限公司；中性蛋白酶（2×106U/g）、無水乙醇（均為食品級(jí)）：北方霞光食品添加劑有限公司；氫氧化鈉、硫酸鋁、苯酚、濃硫酸、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、L-鼠李糖、乙腈（均為分析純）：天津贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠；蟲草素標(biāo)品（色譜純）：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 主要儀器設(shè)備

酶解罐、雙頻超聲波發(fā)生器：天津市食品研究所有限公司自制；DZ-1AI電熱烘干箱、全波長紫外分光光度計(jì)、凱氏定氮儀：天津市泰斯特儀器有限公司；YLS-16A快速水分測定儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司；LC-100高效液相色譜儀：日本島津公司；DGT-ZF-3雙效蒸發(fā)器：天津德固特科技有限公司；離心式噴霧干燥器：常州力馬干燥設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

培養(yǎng)基殘基→分選→破碎→雙頻超聲波輔助提取、酶解→滅酶→過濾→濃縮→噴霧干燥

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 分選

去除在運(yùn)輸及貯藏過程中發(fā)生霉變或被污染的培養(yǎng)基。

1.3.2.2 破碎

加入培養(yǎng)基干基重量5倍～10倍的水，使用高剪切破碎機(jī)進(jìn)行打漿破碎。破碎后的物料無明顯顆粒（≥0.2 cm3）。

1.3.2.3 雙頻超聲波輔助提取及酶解

將破碎的料漿置于加裝25 kHz和40 kHz雙頻超聲波裝置的提取罐，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5，升溫至40℃～60℃，加入一定量中性蛋白酶，開啟攪拌，選擇超聲波功率200 W～400 W，處理20 min～60 min后，關(guān)閉超聲，繼續(xù)酶解2 h～5 h。

1.3.2.4 滅酶

將物料升溫至85℃，保持20 min，滅酶、殺菌。

1.3.2.5 過濾

酶解后的料液使用40目濾布進(jìn)行粗濾，濾液使用80目板框過濾機(jī)進(jìn)行過濾。

1.3.2.6 濃縮

濾液使用雙效蒸發(fā)器濃縮至可溶性固形物≥25%。

1.3.2.7 噴霧干燥

使用離心式噴霧干燥器進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度150℃，出風(fēng)溫度80℃，噴霧干燥后的粉末水分含量≤5%。取樣進(jìn)行多糖、粗蛋白含量、多肽含量（5000Da～10 000 Da）、游離氨基酸含量、蟲草酸、蟲草素的測定。

1.3.3 超聲波輔助工藝提取正交分析

根據(jù)丘泰球、曾榮華等[8-10]的研究結(jié)果25 kHz與40 kHz的雙頻超聲波對(duì)于植物中功效成分的提取效果最佳，因此本研究采用超聲頻率為25 kHz與40 kHz雙頻超聲波進(jìn)行輔助提取，以料液比1∶8（g/mL），超聲功率300 W、處理40 min、溫度55℃，pH7.0為基礎(chǔ)條件，進(jìn)行料液比=1∶5、1 ∶6、1 ∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g/mL），超聲波功率 200、250、300、350、400 W，處理 20、30、40、50、60、70、80、90 min，處理溫度 45、50、55、60、65 ℃等單因素的水平試驗(yàn)。處理后直接取料液，6 000 r/min離心10 min后，取上清液，進(jìn)行多糖檢測，通過與預(yù)先檢測的未提取前物料的多糖含量計(jì)算提取率，確定各因素最佳條件為料液比、超聲波功率、處理溫度、處理時(shí)間在各自因素水平上的最佳條件為：1∶8（g/mL）、300 W、50 min、60 ℃。

據(jù)此設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，因素包括：料液比、超聲波功率、處理溫度、處理時(shí)間，因素水平表見表2。

表2 雙頻超聲波輔助提取優(yōu)化條件試驗(yàn)因素和水平Table 2 Dual-frequency ultrasound assisted extraction optimization condition test factors and levels

1.3.4 酶解工藝正交分析

采用的中性蛋白酶活力為2×105U/g，建議使用量為0.2%～0.8%，pH值為6～8，酶解溫度45℃～65℃。在最佳雙頻超聲波輔助提取條件下，以中性蛋白酶0.5%、（以物料干基重計(jì)），pH7.0，酶解溫度50℃、酶解4 h為基礎(chǔ)條件，進(jìn)行中性蛋白酶添加量0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%，pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，酶解時(shí)間 2、3、4、5、6、7 h，酶解溫度 40、45、50、55、60、65℃單因素的水平試驗(yàn)。處理后直接取料液，6 000 r/min離心10 min后，取上清液，進(jìn)行總氮及氨基酸態(tài)氮的檢測，通過計(jì)算水解度，確定各因素最佳條件為中性蛋白酶添加量、pH值、值酶解溫度、酶解時(shí)間為在各自因素水平上的最佳條件為：0.5%、7.0、55℃、4 h。

據(jù)此設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，因素包括：中性蛋白酶添加量、pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度，因素水平表見表3。

表3 酶解工藝條件試驗(yàn)因素和水平Table 3 Enzyme hydrolysis condition test factors and levels

2 結(jié)果與討論

2.1北冬蟲夏草副產(chǎn)物超聲波輔助提取工藝條件研究

北冬蟲夏草副產(chǎn)物超聲波輔助提取正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

由正交試驗(yàn)可知，所選各因素在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)北冬蟲夏草副產(chǎn)物功能因子的提取效果有不同的影響，各因素對(duì)提取率影響的順序?yàn)镈＞B＞C＞A，最佳的提取條件為A2B2C2D3。即料液比為1∶8（g/mL），超聲波功率300 W，處理時(shí)間50 min，處理溫度65℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，提取率為91.7%，多糖提取效果優(yōu)于正交試驗(yàn)結(jié)果。

表4 北冬蟲夏草副產(chǎn)物超聲波輔助提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 C.militaris by-product of ultrasonic assisted extraction of orthogonal test results

2.2 酶解工藝條件研究

酶解工藝條件研究正交試驗(yàn)見表5。

表5 北冬蟲夏草副產(chǎn)物超聲波酶解正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The results of orthogonal test of C.militaris by-product ultrasonic enzyme

由表5可知，所選各因素在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)北冬蟲夏草副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的酶解效果有不同的影響，各因素對(duì)水解度影響的順序?yàn)锳＞B＞C＞D，最佳的酶解條件為A3B3C3D2，即中性蛋白酶添加量0.6%、pH7.5、酶解時(shí)間為5 h、酶解溫度為55℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，水解度為35.7%，優(yōu)于正交試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 北冬蟲夏草副產(chǎn)物提取物營養(yǎng)成分及功能因子分析

取3個(gè)批次噴霧干燥后的提取物粉末進(jìn)行多糖、粗蛋白、多肽、蟲草酸、蟲草素含量的測定。測定結(jié)果見表6。

表6 北冬蟲夏草副產(chǎn)物提取物功能因子含量Table 6 C.militaris by-product Extract function factor content%

由表6可知，北冬蟲夏草副產(chǎn)物提取物多糖含量少于北冬蟲夏草子實(shí)體，粗蛋白含量、多肽含量、蟲草酸、蟲草素均明顯高于干燥子實(shí)體。經(jīng)酶解處理后的副產(chǎn)物提取物多肽含量是未經(jīng)酶解處理子實(shí)體的近10倍，蟲草酸含量超過子實(shí)體含量近50%，蟲草素含量超過子實(shí)體含量1倍。通過將北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基進(jìn)行提取與酶解，不僅將廢物綜合利用，同時(shí)營養(yǎng)價(jià)值大幅提升。

3 結(jié)論

通過研究，北冬蟲夏草副產(chǎn)物功能因子提取的最佳工藝為將采收后的北冬蟲夏草培養(yǎng)基殘基按干物質(zhì)重量加入8倍凈化水，使用高剪切破碎機(jī)破碎，使用10目篩網(wǎng)過濾后加入至安裝25 kHz和40 kHz雙頻超聲波發(fā)生裝置的提取罐內(nèi)進(jìn)行提取，首先開啟攪拌，調(diào)節(jié)pH值至7.5，之后將物料升溫至65℃，加入干基重0.6%的中性蛋白酶，開啟超聲波發(fā)生裝置進(jìn)行輔助提取。超聲波功率300 W，開啟50 min，處理溫度65℃。超聲波輔助提取結(jié)束后，將溫度降至55℃繼續(xù)進(jìn)行酶解，酶解310 min后，將料液升溫至85℃并保溫20 min滅酶、殺菌。經(jīng)檢測多糖提取率為91.7%，水解度為35.7%，干燥提取物中多糖含量為22.0%、粗蛋白含量45.6%、多肽含量23.7%、蟲草酸含量5.2%、蟲草素含量0.6%。

[1] 邵力平.真菌分類學(xué)[M].北京:中國林業(yè)出版社,1984:11091

[2] 張顯科,王玉柱,劉文霞,等.北冬蟲夏草與冬蟲夏草化學(xué)成分比較[J].遼寧大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1996,23(4):79-82

[3]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).衛(wèi)生部關(guān)于批準(zhǔn)蛹蟲草為新資源食品的公告(2009年第3號(hào))[EB/OL].(2009-03-18).http://www.nhfpc.gov.cn/zwgkzt/wsbysj/200903/39591.shtml

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The Research of Cordycepsmilitaris By-products Function Factor Extraction Process

ZHANG Bin，LIU Bo-hua，WEN Lu-yun
（Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

Cordycepsmilitaris by-products is medium after picked fruit bodyand mycelium.Main active ingredient is similar to fruiting body including Cordycepsmilitaris polysaccharide，cordyceps acid，cordycepin，adenosine，protein，etc.The research adopts the dual-frequency ultrasound assisted extraction technology，enzyme engineering technology，extract of Cordycepsmilitaris polysaccharide，cordycepin，cordyceps acid，polypeptide，from C.militaris by-products.In the dry extract，polysaccharide content was 25.4%，cordycepin content was 0.6%，cordyceps acid content was 5.2%，polypeptide content was 23.7%.

Cordycepsmilitaris by-products；dual-frequency ultrasound；enzyme engineering technology

2017-03-31

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.013

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（16YFFCZ00170）

張斌（1984—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：保健、功能食品加工技術(shù)。