超聲波提取棗樹皮中總黃酮的條件研究

王英超，金紅，王燕霞，張平平

（1.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津300384；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

超聲波提取棗樹皮中總黃酮的條件研究

王英超1，金紅2，*，王燕霞1，張平平3

（1.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津300384；3.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

采用超聲波法提取金絲小棗棗樹皮中的總黃酮。通過單因素試驗研究了料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間、超聲功率和超聲溫度等因素對總黃酮提取率的影響，并進行了四因素三水平正交試驗，確定了棗樹皮總黃酮的最佳提取條件。結(jié)果表明：最佳提取條件為料液比1∶15（g/mL），乙醇體積分數(shù)50%，提取時間50 min，超聲功率342 W，提取溫度70℃，提取兩次。此條件下總黃酮的平均提取率為5.53%。

超聲波；棗樹皮；黃酮；正交試驗

黃酮類物質(zhì)屬于多酚類，是在各種植物體中存在較多的一種天然成分[1]，具有抗癌[2]、抑菌[3]、鎮(zhèn)痛消炎[4]的作用。棗樹皮為棗樹樹干或樹枝的外層，顏色為褐色或者灰褐色，具有止瀉、祛痰、鎮(zhèn)咳、止血等作用[5-7]。20世紀90年代后，利用棗提取黃酮的研究多以棗樹的葉和果實為研究對象[8-11]，對于利用棗樹皮提取總黃酮類物質(zhì)的研究鮮見報道，筆者采用超聲波法提取棗樹皮中總黃酮類物質(zhì)，研究了料液比、乙醇濃度、時間、超聲功率和溫度等5個單因素對棗樹皮中總黃酮提取率的影響，正交試驗確定了最佳提取條件，為棗樹皮資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金絲小棗棗樹皮：采自河北省滄州市棗園。蒸餾水洗凈后，60℃烘干，粉碎過70目篩備用。

1.2 主要試劑

無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸和抗壞血酸：購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硝酸鋁：購自天津市精細化工研究所；三羥甲基氨基甲烷：購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鄰苯三酚：購自Sigma-Aldrich；蘆?。嘿徸陨虾Ｒ量ㄉ锛夹g(shù)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼：購自上海市瑞永生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；YS-08小型高速粉碎機：北京燕山正德機械設(shè)備有限公司；P180H超聲波清洗器：Elma-Hans Schmidbauer GmbH；L550低速離心機：長江湘儀離心機儀器有限公司；TE 4101-L電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Alpha-1500紫外可見分光光度計：上海譜元儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司；STARTER 3100 pH計：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 標準曲線的制作

稱取蘆丁標準品10 mg，用75%乙醇溶解并定容至100 mL。取5支試管編號，分別吸取蘆丁標準品溶液 1、2、3、4、5 mL 于試管中，再分別對應(yīng)加入 4、3、2、1、0 mL 75%乙醇溶液于5支試管中。各管分別加入1 mL 5%NaNO2溶液，振搖混勻，放置6 min；接著加入1 mL 10%Al（NO3）3溶液，振搖反應(yīng) 6 min；再加入10 mL 4%NaOH溶液，搖勻靜置15 min。以75%乙醇為對照，在510 nm處測定1～5號試管的吸光度值。以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得到蘆丁標準曲線方程為y=7.897 1x-0.015 4，R2=0.994 8。

1.4.2 不同料液比對棗樹皮總黃酮提取率的影響

準確稱取棗樹皮粉末1 g，放入50 mL三角瓶中，按料液比 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）分別加入70%的乙醇。50℃，超聲功率80%（超聲最大功率304 W）的條件下超聲30 min，共提取兩次。將兩次超聲提取液合并之后，4 000 r/min離心10 min。取上清液各2.5 mL于5支25 mL比色管中，后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進行。計算不同料液比下黃酮的提取率。計算公式為：

提取率/%=C×稀釋體積×V1×100/（V2×m）

式中：C為棗樹皮提取液總黃酮濃度，mg/mL；V1為提取液體積，mL；V2為取樣體積，mL；m為所用棗樹皮粉末質(zhì)量，mg。以棗樹皮中總黃酮的提取率為評價指標，探討不同的料液比對棗樹皮總黃酮提取率的影響。

1.4.3 不同乙醇體積分數(shù)對棗樹皮總黃酮提取率的影響

稱取棗樹皮粉末1 g，共5份，放入5個50 mL三角燒瓶中，按1∶15（g/mL）的料液比加入30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，充分混勻后，50℃，304 W的條件下超聲30 min，提取兩次。提取液合并后，4 000 r/min離心10 min。后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進行。探討乙醇體積分數(shù)對超聲提取棗樹皮總黃酮提取率的影響。

1.4.4 不同提取時間對棗樹皮總黃酮提取率的影響

稱取棗樹皮粉末1 g，共6份，放入6個50 mL三角燒瓶中，按料液比1∶15（g/mL）加入50%的乙醇，50 ℃，304W 下，分別超聲提取 20、30、40、50、60、70 min，提取兩次。后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進行，研究不同的提取時間對棗樹皮總黃酮提取率的影響。

1.4.5 不同超聲功率對棗樹皮總黃酮提取率的影響

稱取棗樹皮粉末1 g，共6份，放入6個50 mL三角燒瓶中，按料液比1∶15（g/mL）加入50%乙醇，分別在超聲功率 152、190、228、266、304、342 W，50 ℃的條件下，超聲60 min，提取兩次。后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進行，探討不同的超聲功率對棗樹皮總黃酮提取率的影響。

1.4.6 不同超聲溫度對棗樹皮總黃酮提取率的影響

分別稱取棗樹皮粉末1 g，共6份，放入6個50 mL三角燒瓶中，按1∶15（g/mL）的料液比加入50%乙醇，分別在 30、40、50、60、70、80℃，超聲功率 266 W 的條件下，超聲60 min，提取兩次。提取液合并后，4 000 r/min離心10 min。后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進行，探討不同的超聲溫度對棗樹皮總黃酮提取率的影響。

1.4.7 正交試驗

選取料液比、提取時間、超聲功率和溫度4個因素進行四因素三水平正交試驗。以棗樹皮總黃酮提取率為指標，確定超聲提取棗樹皮總黃酮的最佳提取條件。因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 不同料液比對棗樹皮總黃酮提取率的影響

不同料液比對棗樹皮總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖1。

從圖1中可以看出，在料液比1∶5（g/mL）至1∶15（g/mL）內(nèi)，總黃酮提取率隨著料液比的升高而升高，在1∶15（g/mL）時達到最大值1.9%，隨后開始下降。這是由于料液比處于一定范圍時，隨著溶劑的量增大，提取率升高。當(dāng)溶劑的量超過某一范圍后，雜質(zhì)溶出增大，與原材料中的黃酮競爭性溶出導(dǎo)致提取得率下降[12]，故從成本方面考慮料液比應(yīng)為1∶15（g/mL）。

2.2 不同乙醇體積分數(shù)對棗樹皮總黃酮提取率的影響

不同乙醇體積分數(shù)對棗樹皮總黃酮提取率的影響見圖2。

圖1 不同料液比對棗樹皮總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of different solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from jujube peel

圖2 不同乙醇濃度對棗樹皮總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids from jujube peel

隨著乙醇濃度的增大，棗樹皮總黃酮的提取得率也隨其增大，在乙醇濃度達到50%時，提取率達到2.43%，之后開始隨著乙醇體積分數(shù)的增大而降低。黃酮類化合物在植物體中存在種類眾多，乙醇體積分數(shù)在30%～50%范圍內(nèi)時提取得率較高，可能是由于溶液極性與棗樹皮多數(shù)黃酮類物質(zhì)極性相近，目標產(chǎn)物比較容易溶入提取劑中；之后，乙醇體積分數(shù)增大，極性降低，與黃酮類物質(zhì)極性的相似程度降低，從而不利于黃酮類物質(zhì)的溶出，提取率開始下降[13]。

2.3 不同提取時間對棗樹皮總黃酮提取率的影響

不同提取時間對棗樹皮總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖3。

如圖3所示，總黃酮的提取率隨著提取時間的提高而呈現(xiàn)平緩上升的趨勢，在60 min時，總黃酮提取率為2.7%。超過60 min提取率下降。這可能是因為提取時間過短，黃酮還沒有被完全提取出來，造成提取得率比較低；時間過長，棗樹皮黃酮類物質(zhì)部分被分解或者氧化，從而導(dǎo)致目標產(chǎn)物提取得率的降低[14]。因此利用超聲對棗樹皮總黃酮類物質(zhì)的提取時間為60 min。

2.4 不同超聲功率對棗樹皮總黃酮提取率的影響

不同超聲功率對棗樹皮總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖3 不同提取時間對棗樹皮總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extract time on the extraction rate of total flavonoids from jujube peel

圖4 不同超聲功率對棗樹皮總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction of total flavonoids from jujube peel

在超聲功率為152 W～266 W的區(qū)間內(nèi)棗樹皮總黃酮提取率近直線上升，在266 W時，總黃酮提取率達到2.75%。之后隨著超聲功率的持續(xù)增大，總黃酮提取率下降。超聲功率較低時，超聲產(chǎn)生的機械效應(yīng)達不到使棗樹皮細胞壁破壞的程度，黃酮的浸出阻力增大，導(dǎo)致提取得率比較低。但隨著超聲功率的過量加大，超聲過程所產(chǎn)生的空化效應(yīng)使棗樹皮中的成分溶出加快，導(dǎo)致了棗樹皮中雜質(zhì)的溶出增加；熱效應(yīng)使分子運動更加劇烈，導(dǎo)致黃酮成分與提取出的雜質(zhì)分子相互反應(yīng)，從而導(dǎo)致棗樹皮黃酮的提取得率下降[15]。因此，確定提取總黃酮的超聲功率為266 W。

2.5 不同超聲溫度對棗樹皮總黃酮提取率的影響

不同超聲溫度對棗樹皮總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖5。

總黃酮提取率隨著溫度的升高而緩慢上升，至70℃時達到5.19%。之后隨著溫度的升高，提取率下降。溫度的增加可以加快分子運動，加快棗樹皮中目標成分的擴散速度和溶出速度，使更多的棗樹皮黃酮成分溶出[16]；溫度過高，易導(dǎo)致乙醇揮發(fā)，造成溶劑減少，也有可能溫度過高導(dǎo)致浸出的黃酮類物質(zhì)成分被破壞，從而導(dǎo)致了提取率的下降。因此，確定提取總黃酮的超聲溫度為70℃。

2.6 正交試驗結(jié)果

采用L9（34）正交試驗確定最佳超聲提取條件。試驗結(jié)果如表2所示。

圖5 不同超聲溫度對棗樹皮總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of different ultrasonic temperature on the extraction of flavonoids from Jujube peel

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由極差分析可知，對棗樹皮總黃酮提取率的影響因素大小為料液比、時間、溫度、功率。正交試驗得到最佳提取條件為 A2B1C3D2，即料液比 1 ∶15（g/mL），時間50 min，功率342 W，溫度70℃。根據(jù)得到的最佳提取工藝，進行三組驗證試驗，測得棗樹皮總黃酮提取率為5.53%。

3 討論

常規(guī)提取天然產(chǎn)物的方法有冷浸提取、索氏提取和回流提取。冷浸提取法由于不用加熱，可以避免對原材料中的某些目標產(chǎn)物的破壞，但是所用時間較長；索氏提取由于需要將原料長期浸潤，所以對于提取劑的消耗量比較大；回流提取由于對原料加熱時間較長，所以不適用于對溫度敏感的物質(zhì)的提取，同時用時較長。超聲提取由于其作用原理的不同——直接作用于原材料細胞，并且具有空化、機械等效應(yīng)，具有提取產(chǎn)率高，節(jié)省提取時間，節(jié)約成本等優(yōu)點在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，單因素試驗時，當(dāng)超聲溫度升至70℃時，具有最高的提取得率；正交試驗時，最佳超聲溫度水平同樣為70℃，與程力惠、徐礪瑜等[17-18]報道的提取核桃楸樹皮與楊梅樹皮中黃酮的超聲溫度不一致。這是由于各品種中的樹皮成分不一致，樹皮中黃酮種類也不盡相同，棗樹皮中對熱穩(wěn)定的黃酮類物質(zhì)占比較大，所以在溫度較高時仍然有較高的提取率。

4 結(jié)論

確定棗樹皮總黃酮的超聲提取最佳工藝組合為：料液比 1 ∶15（g/mL），乙醇濃度 50%，時間 50 min，超聲功率342 W，超聲溫度70℃，提取兩次。通過三組驗證試驗，得到棗樹皮總黃酮的提取率為5.53%。

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Study on the Conditions of Total Flavonoids from Jujube Peel by Ultrasonic Extraction

WANG Ying-chao1，JIN Hong2，*，WANG Yan-xia1，ZHANG Ping-ping3
（1.College of Basic Science，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China；2.College of Agronomy and Resource Environment，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China；3.College of Food Science and Biotechnology，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）

Total flavonoids from jujube peel was extracted by ultrasonic method.Experiments of single factor including solid-liquid ratio，ethanol concentration，extraction time，ultrasonic power and temperature were done to find the influence of various factors on the extraction rate.Based on single factor experiments，four factor and three level orthogonal test was designed.The results showed that optimum extraction conditions of total flavonoids from jujube peel were solid-liquid ratio 1∶15 （g/mL），50%ethanol concentration，extraction time 50 min，power of 342 W，temperature 70℃，two step extraction.The average extraction rate of total flavonoids was 5.53%.

ultrasound；jujube peel；total flavonoids；orthogonal test

2016-09-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.012

天津市科技支撐項目（11ZCKFNC01600）

王英超（1981—），女（漢），實驗師，碩士，研究方向：生物化學(xué)實驗教學(xué)與研究工作。

*通信作者：金紅（1967—），女（漢），研究員，碩士，研究方向：主要從事生物化學(xué)教學(xué)與生物技術(shù)研究。