六盤水苦蕎麥黃酮的體外抗氧化活性的研究

方玉梅，譚萍

（六盤水師范學(xué)院，貴州六盤水553004）

六盤水苦蕎麥黃酮的體外抗氧化活性的研究

方玉梅，譚萍

（六盤水師范學(xué)院，貴州六盤水553004）

以苦蕎麥為原料，用70%的乙醇通過浸提法提取苦蕎麥中的黃酮，并將提取的黃酮進(jìn)行純化。采用DPPH、ABTS、羥基自由基3種方法檢測純化前和純化后苦蕎麥黃酮的抗氧化效果。試驗(yàn)表明，純化前和純化后苦蕎麥黃酮都具有抗氧化能力，并與黃酮濃度呈正相關(guān)。對DPPH自由基的清除作用中，純化前和純化后黃酮濃度為0.005%時，清除率分別為41.8%和61.6%；對ABTS+自由基的清除作用中，純化前和純化后黃酮濃度為0.005%時，清除率分別為54.7%和61.1%；在對OH自由基的清除作用中，純化前和純化后黃酮的濃度為0.1%，清除率分別為14.7%和10.3%。對DPPH自由基和ABTS自由基的抗氧化作用，純化前的黃酮弱于純化后的黃酮；對羥基自由基，純化前的黃酮強(qiáng)于純化后的黃酮。

黃酮；抗氧化；DPPH；ABTS；羥基自由基

苦蕎麥[Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn.]，屬蓼科蕎麥屬植物，俗稱苦蕎，一年生草本植物。生長在田邊、路旁等潮濕地帶?？嗍w麥?zhǔn)巧跎俚奶烊凰幨硟捎米魑颷1]。現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)觀察表明，苦蕎麥具有防治冠心病、糖尿病、高血壓、抗癌、防止內(nèi)出血、延緩衰老等多種生理功能[2]。研究表明苦蕎麥這些生理功能和藥用價值與苦蕎麥中富含生物類黃酮有十分密切關(guān)系[3]。目前關(guān)于苦蕎麥黃酮類化合物的研究主要以極性較大的混合溶劑提取的粗提取物為對象，但其中成分復(fù)雜，不僅含有黃酮，而且含有色素和醇溶性小分子[4]。為了弄清苦蕎麥黃酮的性質(zhì)，本試驗(yàn)主要以六盤水苦蕎麥為材料，同時采用DPPH、ABTS、羥基自由基3種方法對純化前和純化后的苦蕎麥黃酮的抗氧化能力進(jìn)行評價，對六盤水苦蕎麥的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦蕎麥種子（六苦4號）：由六盤水職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)工程系苦蕎麥育種基地提供。

1.2 試驗(yàn)藥品

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二銨鹽（ABTS）：Sigma公司；鄰苯三酚、七水硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、無水乙醇、過硫酸鉀：市售分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

722S可見分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；JD200-3多功能電子天平：沈陽龍騰電子標(biāo)量儀器有限公司；H.H.S電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；DFT-200高速萬能粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；60目，孔徑0.3毫米標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩：浙江上虞市道墟張興紗篩廠；HA-BII.402-BS-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；7D25臺式低速離心機(jī)：湖南赫兩儀器裝備有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品處理和樣品制備

將采取的苦蕎麥置于60℃的烘箱中烘干至恒重，然后將其取出用粉碎機(jī)粉碎，過60目的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩，放在恒溫烘箱中備用。

純化前的黃酮：準(zhǔn)確稱取5 g苦蕎麥粉末于圓底燒瓶中，按料液比1∶30（g/mL）加入70%的乙醇置于65℃水浴鍋中水浴提取1.5 h[5]，以4 000 r/min離心5 min，取上清液，去殘?jiān)?，將上清液置?0℃水浴鍋中濃縮，干燥后即得樣品。

純化后的黃酮：取潔凈的層析柱（底部塞有棉花），按1∶4的徑高比加入大孔吸附樹脂AB-8，準(zhǔn)確量取1 0 mL濃度為0.02%的黃酮上樣液加入層析柱中，以2 mL/min的流速過柱，待上樣液過柱后，再加入10 mL蒸餾水以相同的流速過柱，待蒸餾水完全過柱后再加入10 mL 50%的乙醇以3 mL/min的流速過柱，收集洗脫液于60℃水浴鍋中濃縮，干燥后即得樣品。

2.2 純化前和純化后苦蕎麥黃酮的抗氧化作用

2.2.1 純化前和純化后苦蕎麥黃酮對DPPH自由基清除作用試驗(yàn)

DPPH·（二苯代苦味酰自由基）是一種合成穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液顯紫色，在517 nm處有最大吸收。當(dāng)有供氧能力的抗氧化劑存在時，抗氧化劑就會提供氫離子和電子給DPPH自由基，與其發(fā)生反應(yīng)，使D PPH溶液的顏色變淺，吸光度值變小。其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計測得其吸光度值，進(jìn)行定量分析。

DPPH母液的配制：根據(jù)譚萍等[6]報道的方法，準(zhǔn)確稱取44 mgDPPH，用無水乙醇定容至100 mL，將其配制成120 μmol/LDPPH母液，在0℃～4℃條件下避光放置。

純化前后黃酮溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.01 g純化前的黃酮和純化后的黃酮，分別用20 mL蒸餾水溶解，配制成濃度為0.05%的樣品液，然后分別稀釋成濃度為0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%的黃酮溶液。

DPPH工作液的配制：2 mL無水乙醇和4 mL DPPH液加入同一試管中，搖勻，避光放置30 min后，以無水乙醇為參比在517 nm處測吸光值記AX；

樣品測定：加入黃酮溶液（0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%）2 mL與4 mLDPPH液于同一比色管中（每個濃度做3次重復(fù)試驗(yàn)），搖勻，避光放置30 min后，以無水乙醇為參比在517 nm處測吸光值記AJ；按以下公式計算清除率：

清除率/%=[（AX-AJ）/AX]×100

式中：AX為DPPH與溶劑混合后的吸光值；AJ為DPPH和樣液反應(yīng)后的吸光值。

2.2.2 純化前和純化后苦蕎麥黃酮對羥基自由基清除作用試驗(yàn)

按照Smirnof的方法[7]，利用H2O2與FeSO4混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生紫色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有最大吸收峰，加入抗氧化劑就可以將羥基自由基清除，使紫色溶液顏色變淡。

純化前后的黃酮溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.05 g純化前的黃酮和純化后的黃酮，分別用50 mL蒸餾水配置成濃度為0.1%的樣品液，然后分別稀釋成濃度為0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%的樣品液。

反應(yīng)體系：在同一比色管中加入7.5 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇，2.5 mL6 mmol/L H2O2，2.5 mL 2 mmol/L七水硫酸亞鐵（每個濃度做3次重復(fù)試驗(yàn)），搖勻，置于37℃的水浴鍋中水浴15 min，取5 mL溶液在510 nm波長處測吸光值記A0；再向剩下的溶液中加入0.5 mL不同濃度的樣品液（0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%），搖勻，放置在37℃的水浴鍋中水浴15 min后在510 nm處測其吸光值記AX。

對照試驗(yàn)：由于黃酮本身含有吸收光值，所以需做一組對照試驗(yàn)。在同一比色管中加入7.5mL6mmol/L水楊酸-乙醇，2.5 mL蒸餾水，2.5 mL 2 mmol/L七水硫酸亞鐵（每個濃度做3次重復(fù)試驗(yàn)），搖勻，置于37℃的水浴鍋中水浴15 min后，取5 mL溶液棄去，向剩下的溶液中加入0.5 mL的樣品液后繼續(xù)水浴15 min，在510 nm處測吸光值記AX0。按以下公式計算清除率：

清除率/%=[A0-（AX-AX0）]/A0×100

式中：A0為未加樣品液的吸光值；AX為加樣品液的吸光值；AX0樣品本身的吸光值。

2.2.3 純化前和純化后苦蕎麥黃酮對ABTS+·清除作用試驗(yàn)

根據(jù)李華等報道的方法[8]進(jìn)行改進(jìn)，其原理是ABTS在有氧化劑的作用下會被氧化成藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS+·，向其中加入被測物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會與ABTS+·發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，在734 nm處測吸光度即可測出并計算出樣品的抗氧化能力。

ABTS母液的配置：取5 mL 7 mmol/L的ABTS與88 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀混合均勻，在常溫下避光保存12 h，形成ABTS母液。

工作液的配制：使用前用70%乙醇將ABTS母液稀釋120倍，使其在734 nm處的吸光值在0.65～0.75范圍內(nèi)，之后以70%乙醇作為參比在734 nm處測吸光度值。

純化前后黃酮溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.025 g純化前和純化后的黃酮，分別用50 mL蒸餾水溶解，配成濃度為0.05%的樣品液，然后分別稀釋成濃度為0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%的樣品液。

反應(yīng)體系：取1 mL的樣品液（0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%）與4 mL工作液于同一比色管中（每個濃度做3次重復(fù)試驗(yàn)），并同時計時后避光放置反應(yīng)6 min，在734 nm處以70%乙醇為參比測其吸光值記AX（在測反應(yīng)物前，先測工作液的吸光值記A0）。按以下公式計算清除率：

清除率/%=（A0-AX）/A0×100

式中：A0為工作液的吸光值；AX為加樣品液的吸光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 純化前后苦蕎麥黃酮對DPPH自由基清除作用

DPPH與溶劑混合后的吸光值A(chǔ)X的值為0.782。因此，根據(jù)公式計算清除率，其結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，純化前和純化后的苦蕎麥黃酮均具有清除DPPH自由基的能力，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，其清除率隨濃度的增加而增加，且黃酮濃度與清除率呈正相關(guān)。黃酮濃度為0.005%時，純化前和純化后清除率分別達(dá)到41.8%和61.1%，由此看出，苦蕎麥黃酮純化后的抗氧化能力明顯高于純化前。原因可能是純化前黃酮中含有的雜質(zhì)不具有抗氧化作用，甚至可能抑制黃酮的抗氧化能力；再有苦蕎麥黃酮經(jīng)過大孔樹脂純化后，提取物中的高活性成分有所增加，黃酮純度也增加，對DPPH自由基的清除效果就會更好，抗氧化能力也就增強(qiáng)，導(dǎo)致純化后的黃酮比純化前的黃酮清除效果更好。

3.2 純化前后苦蕎麥黃酮對羥基自由基清除作用

純化前后苦蕎麥黃酮對羥基自由基清除率如圖2所示。

圖1 純化前和純化后苦蕎麥黃酮對DPPH自由基的清除率折線圖Fig.1 Purified and unpurified of the flavonoids in tartary buckwheat on DPPH free radical clearance line chart

圖2 純化前和純化后苦蕎麥黃酮對羥基自由基的清除率折線圖Fig.2 Purified and unpurified of the flavonoids in tartary buckwheat on·OH clearance line chart

由圖2可知看出，純化前和純化后的苦蕎麥黃酮均具有清除羥基自由基的能力，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，其清除率隨濃度的增加而增加，說明其抗氧化作用逐漸增強(qiáng)，黃酮濃度與清除率呈正相關(guān)。黃酮濃度為0.1%時，純化前和純化后的清除率分別達(dá)到14.7%和10.3%。由此看出，純化前的苦蕎麥黃酮的對羥基自由基的抗氧化能力明顯高于純化后的。可能是因?yàn)辄S酮在提取過程中，苦蕎麥中多數(shù)總黃酮已被提取出來，所以對羥基自由基的清除效果好。當(dāng)對黃酮進(jìn)行純化時，把色素中含有的黃酮純化掉了，所以導(dǎo)致純化前的黃酮對羥基自由基的清除效果比純化后的黃酮的清除效果更好。

3.3 純化前后苦蕎麥黃酮對ABTS+自由基清除作用

在使用工作液前測定工作液的吸光值A(chǔ)0，純前化的吸光度值A(chǔ)0為0.717，純化后的吸光度值A(chǔ)0為0.725。因此，根據(jù)公式計算清除率，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 純化前和純化后苦蕎麥黃酮對ABTS+自由基的清除率折線圖Fig.3 Purified and unpurified of the flavonoids in tartary buckwheat on ABTS+free radical clearance line chart

由圖3可知看出，純化前和純化后的苦蕎麥黃酮均具有清除羥基自由基的能力，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，其清除率隨黃酮濃度的增加而增加，且黃酮濃度與清除率呈正相關(guān)。黃酮濃度為0.005%時，純化前和純化后黃酮對ABTS+自由基的清除率達(dá)到54.7%和61.1%。由此看出，純化后的苦蕎麥黃酮抗氧化能力明顯高于純化前。原因可能是純化前黃酮中含有的雜質(zhì)不具有抗氧化作用，甚至可能抑制黃酮的抗氧化能力，當(dāng)苦蕎麥黃酮經(jīng)過大孔樹脂純化后，其中的雜質(zhì)被去除，提取物中的高活性成分有所增加，黃酮純度也增加，其清除率明顯增強(qiáng)，抗氧化能力也就增強(qiáng)，所以導(dǎo)致純化后的黃酮比純化前的黃酮清除效果更好。

4 結(jié)論

通過對3種體系自由基清除作用研究純化前和純化后苦蕎麥黃酮的抗氧化活性，結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，純化前和純化后苦蕎麥黃酮對3種自由基都具有清除作用，且清除能力隨濃度的增加而增加。當(dāng)濃度為0.005%時，純化前和純化后苦蕎麥黃酮對DPPH自由基的清除率分別是41.8%和61.1%，對ABTS+自由基的清除率分別是54.7%和61.1%；當(dāng)濃度為0.1%時，對羥基自由基的清除率分別為14.7%和10.3%。說明苦蕎麥黃酮具有較好的抗氧化能力。

本試驗(yàn)同時采用3種方法對苦蕎麥黃酮的抗氧化能力進(jìn)行評價，所得結(jié)果證明純化前和純化后的苦蕎麥黃酮都具有較好的抗氧化能力。綜上所述，黔產(chǎn)苦蕎麥黃酮不僅可以作為天然食品著色劑開發(fā)，還可以作為天然抗氧化劑開發(fā)，本試驗(yàn)為苦蕎麥黃酮的高附加值的產(chǎn)品開發(fā)提供一條新途徑。

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Study on the Antioxidant Activity of the Flavonoids from the Tartary Buckwheat in Liupanshui

FANG Yu-mei，TAN Ping
（Liupanshui Normal College，Liupanshui 553004，Guizhou，China）

The flavonoids in tartary buckwheat was extracted by 70%ethanol，and using macroporous resin purified the flavonoids.The antioxidant effect of DPPH，ABTS and hydroxyl free radical three methods were used to detect the effect of the purified and unpurified on the flavonoids from tartary buckwheat.The results showed that purified and unpurified of the flavonoids in tartary buckwheat had the ability of antioxidation，and it was positively correlated with the concentration of flavonoids.In the scavenging action of DPPH free radical，the clearance rates were 41.8%and 61.6%，respectively，when the concentration of purified and unpurified flavonoids was 0.005%；the clearance rate of ABTS was 54.7%and 61.1%，respectively，when the concentration of purified and unpurified flavonoids was 0.005%；in the scavenging effect on OH free radical，the concentration of purified and unpurified flavonoids was 0.1%，and the removal rate was 14.7%and 10.3%respectively.The antioxidation effect for DPPH free radical and ABTS free radical，the purified flavonoids was weaker than the unpurified of flavonoids；to hydroxyl free radical，the purified flavonoids was stronger than the unpurified of flavonoids.

flavonoids；antioxidant free radical；DPPH；ABTS；hydroxyl free radical

2016-08-31

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.002

貴州省教育廳基金項(xiàng)目（黔教合KY字[2014]257號）；貴州省“125計劃”重大科技專項(xiàng)（黔教合重大專項(xiàng)字[2014]038號）；貴州省科技廳技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合J字LKLS[2013]05號）；六盤水師范學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（LPSSYKJTD201602）

方玉梅（1982—），女（布依），副教授，研究生，從事植物生理學(xué)與分子生物學(xué)的教學(xué)與研究。