PAR1、PAR4在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

侯麗娟，翟建軍

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院婦產(chǎn)科(北京 100176)

·臨床病理·

PAR1、PAR4在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義

侯麗娟，翟建軍△

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院婦產(chǎn)科(北京 100176)

目的：對宮頸癌組織中PAR1和PAR4基因的表達(dá)進(jìn)行檢測，并對其相關(guān)的臨床意義進(jìn)行探討。方法：選取宮頸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本84例，所有病例經(jīng)病理確診，對照為癌旁非癌宮頸組織。對患者的年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度及臨床TNM分期分組對照HPV16和P16基因的表達(dá)。RT-PCR檢測PAR1和PAR4 mRNA的表達(dá)，熒光定量PCR檢測PAR1和PAR4基因的表達(dá)量。結(jié)果：宮頸癌標(biāo)本中PAR1和PAR4基因的表達(dá)率分別為63.1%和72.6%，顯著高于癌旁正常對照宮頸組織的21.4%和29.8%(P均<0.01)。PAR1和PAR4基因在宮頸癌標(biāo)本中的表達(dá)量分別為0.61±0.15和0.67±0.17，也顯著高于對照組織的0.13±0.07和0.21±0.08(P均<0.01)。PAR1和PAR4基因的表達(dá)率和表達(dá)量在患者腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床不同分期之間都存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，但不同年齡患者之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。相關(guān)性分析顯示宮頸癌組織中PAR1和PAR4基因的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.664，P<0.01)。結(jié)論：PAR1和PAR4基因的高表達(dá)在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用，對其聯(lián)合檢測有可能用于宮頸癌分化程度的評估、臨床分級以及判斷預(yù)后等方面。

據(jù)調(diào)查顯示，世界各國的腫瘤發(fā)病率及病死率逐年升高，目前已成為繼心血管病之后現(xiàn)代人類的第二大殺手[1]。在女性的惡性腫瘤中,宮頸癌的發(fā)生率僅次于乳腺癌，全世界每年約有50萬婦女患病，居女性生殖道腫瘤發(fā)病首位，且有年輕化的趨勢。對婦科腫瘤的準(zhǔn)確診斷及正確的預(yù)后判斷是近年研究關(guān)鍵點[2-3]。蛋白酶激活受體 (Protease activated receptors, PARs) 是一個G蛋白偶聯(lián)受體家族，有PAR1-4四個成員組成，PARs激活后可以級聯(lián)激活G蛋白調(diào)控下游通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激細(xì)胞增殖、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移，PAR1-3由凝血酶激活，而PAR2由胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶激活[4-5]，目前PAR1研究的比較多，主要集中在黑色素瘤方面，而PAR4則較少涉及[6]。本文對宮頸癌患者組織中PAR1、PAR4基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢查，并對其與宮頸癌的關(guān)系及相關(guān)的臨床意義進(jìn)行探討，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

1 標(biāo)本來源 選取我院2010年1月至2016年6月婦產(chǎn)科行手術(shù)治療的宮頸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本84例，并經(jīng)術(shù)后病理學(xué)診斷證實確診為宮頸癌，其中年齡 36～76 歲，平均年齡(59.2±13.1)歲。根據(jù)臨床TNM分期劃分：I 期患者12例、Ⅱ期患者20例、Ⅲ期患者 31例、Ⅳ期患者 21例，同時每例另取癌旁非癌的正常宮頸組織的鱗狀上皮制成標(biāo)本作為對照。所有入選病例術(shù)前均未接受放療、化療或其他生物治療。

2 主要試劑和儀器 采用Trizol、RT-PCR試劑盒(購自于北京天根生化科技有限公司)及SYBR Green熒光定量檢測試劑盒(購自于大連寶生物公司)。主要儀器有：石蠟切片機(jī)、離心機(jī)，免疫組化專用濕盒、光學(xué)顯微鏡、恒溫箱、冰箱等等。

3 組織的提取及合成

3.1 組織總RNA提取的方法：首先取50～60mg實驗?zāi)[瘤或癌旁，在液氮中研磨勻漿后，加入1 ml Trizol提取細(xì)胞總RNA，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，具體方法如下：吸取實驗組織裂解物置入干凈的1.5ml EP管加入0.2 ml氯仿，在劇烈振蕩15 s 后，放置室內(nèi)15 min，12, 000 rpm 4°C離心15 min，小心吸取上清置入另一支干凈的EP管中。在上清中加入0.5 ml異丙醇，顛倒混合后，室溫靜置10 min后，12 000 rpm 4°C離心10 min，將75% 乙醇輕輕顛倒洗滌沉淀2次，然后加入DEPC水溶解，用紫外分光光度計來測定細(xì)胞總RNA在260 nm和280 nm處的光密度值(OD)，同時計算RNA的含量及純度。

3.2 cDNA第一鏈合成的方法：反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈：2 μg RNA，2 μl Olig (dT)15，1mM dNTP mixture，5mM DTT，200U TIANScript M-MLV，40 U RNasin，4 μl 5×First-Strand Buffer，加入DEPC處理滅菌蒸餾水至總反應(yīng)體系20 μl。在40 °C 下孵育1 h，在95°C時孵育5 min中止反應(yīng)，取其樣品-70°C凍存。

4 RT-PCR步驟

4.1 PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段：2 μl cDNA，0.2 μl Primer F (50 μΜ)，0.2 μl Primer R (50 μΜ)，12.5 μl2× Taq Plus MasterMix，加ddH2O至總反應(yīng)體系25 μl。

擴(kuò)增片段：PAR1：Sence:5'- TTCAGTCTGTGCGGCCCGCTGTT-3'

Antisence: 5'-CCAGGTGCAGCATGTACACCACC -3'；PAR4：Sense: 5'- GGCAACCTCTATGGTGCCTA -3', antisense: 5'- TTCGACCCAGTACAGCC TTC-3'；β-actin: Sence: 5'- TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3'，Antisence: 5'- AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3'。

4.2 擴(kuò)增反應(yīng)的條件：94°C 5 min，94°C 30 s，60°C 40 s，72°C 1 min，35個循環(huán)； 72°C 10 min。100V 2% 瓊脂糖凝膠電泳45 min，凝膠成像儀拍照。

5 實時定量熒光PCR (Real-Time PCR) 參照SYBR Green Real-time PCR檢測試劑盒的使用說明書進(jìn)行操作，采用ABI Prism7500熒光定量PCR儀來檢測PAR1、PAR4基因的表達(dá)情況。0.2ml PCR反應(yīng)管加入上下游引物，反應(yīng)條件為：95C 1min；95C 15s， 60C 15s，72C 20s，35個循環(huán)。以β-actin基因作為內(nèi)參照。PAR1：Sence:5'- CCTTCATCTACTACTACTACGTGTCG-3'

Antisence: 5'- ACTGGAGCAAAGAGGAGTGG -3'；PAR4：Sense: 5'- GGCAACCTCTATGGTGCCTA -3', antisense: 5'- TTCGACCCAGTACAGCC TTC-3'；β-actin: Sence: 5'- ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'，Antisence: 5'- GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'。Ct值表示基因擴(kuò)增達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)，當(dāng) Ct值越小時表明該基因的表達(dá)就越多，顧根據(jù)內(nèi)參的Ct值能夠計算出△Ct值即△Ct值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，通過△Ct值能夠間接的反映出目的基因的相對表達(dá)水平，目的基因的表達(dá)量采用2-△Ct來評估。

結(jié) 果

1 兩組在PAR1和PAR4表達(dá)上的比較 檢測結(jié)果顯示，84例宮頸癌標(biāo)本中檢出PAR1基因的表達(dá)53例(63.1%)，癌旁正常對照組織PAR1基因檢出18例，檢出率為21.4%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P〈0.01)。宮頸癌標(biāo)本中檢出PAR4基因的表達(dá)61例(72.6%)，而癌旁正常對照組織僅有25例檢出PAR4基因，表達(dá)率為29.8%，兩組之間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，見表1。

Real-Time PCR結(jié)果顯示，PAR1基因在宮頸癌標(biāo)本和正常對照組織中的表達(dá)量分別為0.61±0.15和0.13±0.07，兩組之間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)；PAR4基因在宮頸癌標(biāo)本和正常對照組織中的表達(dá)量分別為0.67±0.17和0.21±0.08，兩組之間的表達(dá)量比較亦有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。

2 PAR1和PAR4與病理學(xué)的關(guān)系 患者腫瘤的分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床TNM不同分期與PAR1、PAR4基因的表達(dá)之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而與患者的年齡之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

表1 PAR1和PAR4基因在良、惡性宮頸組織中的表達(dá)[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.01

表2 宮頸癌組織中臨床指標(biāo)與PAR1和PAR4 mRNA表達(dá)之間的關(guān)系

注：不同臨床指標(biāo)兩組之間比較，*P<0.05，△P<0.01

3 宮頸癌組織中PAR1和PAR4基因表達(dá)的相關(guān)性分析 Spearman等級相關(guān)分析顯示宮頸癌組織中PAR1和PAR4基因的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.664，P<0.01)。

討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多階段、多因素、多步驟、多基因的漫長演化過程。蛋白酶激活受體(PAR)1、4是凝血酶的下游靶蛋白，在多種實體腫瘤中表達(dá)上調(diào)，例如黑色素瘤、乳腺癌、肝癌等，另外凝血酶本身對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，并且還可以刺激腫瘤血管的生成，提示了PAR1和PAR 4在惡性腫瘤中的檢測意義重大[7]。PAR1和PAR 4具有7個跨膜單位，只有在胞外區(qū)水解后，受體的胞內(nèi)區(qū)才能發(fā)揮活性，其主要是通過調(diào)節(jié)G蛋白的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮生物學(xué)特性，例如激活Src激酶活化Erk通路；增加EGFR的磷酸化；活化NF-κB通路；激活MMPs途徑等，上述的信號通路都與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系[8]。我們對宮頸癌組織PAR1和PAR 4基因表達(dá)的檢測顯示癌組織中PAR1和PAR 4基因的表達(dá)率和表達(dá)量顯著高于癌旁對照宮頸組織(P<0.01)，提示了PAR1和PAR 4基因的激活在宮頸癌發(fā)生中起重要作用。

有研究顯示PAR-1可以通過調(diào)節(jié)縫隙連接蛋白Connexin 43和腫瘤抑制基因Maspin的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，并且使用凝血酶或者PAR-1的激活劑可以喚醒處于休眠期的腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞的有絲分裂，增加細(xì)胞的侵襲和遷移能力，在一項胃癌的研究中顯示PAR-1的表達(dá)與腫瘤的侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9-10]。在肝癌中的研究顯示PAR-4的拮抗劑可以減弱凝血酶介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移活性，顯示PAR-4可以作為一個腫瘤治療的靶點[5]。上述的研究提示PAR1和PAR 4有可能成為腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后評估的有效標(biāo)志，值得進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果顯示，PAR1、PAR4基因的表達(dá)與宮頸癌分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床不同分期之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，并且PAR1和PAR4的表達(dá)有隨著腫瘤分化程度的減低，淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和臨床分期的進(jìn)展而表達(dá)逐漸增加的趨勢，這表明PAR1和PAR4在宮頸癌的惡性程度判定上具有一定的敏感性，能夠預(yù)示著患者的預(yù)后。另外相關(guān)性分析顯示PAR1和PAR4在宮頸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示PAR1和PAR4的聯(lián)合檢測將會提高二者的臨床應(yīng)用價值。

綜上所述，PAR1和PAR4在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中具有一定的作用，對腫瘤的分級、判斷預(yù)后等方面有指導(dǎo)意義，值得臨床上進(jìn)一步研究和探討。

[1] Jemal A, Siegel R, Xu J,etal. Cancer statistics, 2010[J]. Ca Cancer J Clin，2011，60(5):277-300.

[2] 袁 淵，常曉斌，姚安梅，等.HIF-2α在宮頸癌組織中的表達(dá)及意義[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2015，44(7)：797-800.

[3] Armstrong EP. Prophylaxis of cervical cancer and related cervical disease: a review of the cost-effectiveness of vaccination against oncogenic HPV types[J].J Manag Care Pharm, 2010, 16(3):217-230.

[4] 李 軒, 謝立群. PARs與消化系腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 世界華人消化雜志, 2009, 17(21): 2179-2183.

[5] 李思熳,高振華.PAR家族在消化道腫瘤中的作用[J].中國普通外科雜志,2013,22(2):218-222.

[6] Villares GJ, Zigler M, Bar-Eli M. The emerging role of the thrombin receptor (PAR-1) in melanoma metastasis-a possible therapeutic target[J]. Oncotarget, 2011, 2(1-2):8-17.

[7] Elste AP, Petersen I. Expression of proteinase-activated receptor 1-4 (PAR 1-4) in human cancer[J]. J Mol Histol, 2010, 41(2-3):89-99.

[8] 李 燕,沈 霖,湯 文.維持性血液透析患者血小板凝血酶受體的表達(dá)及其意義[J].中國全科醫(yī)學(xué),2012,15(12):1403-1404.

[9] Villares GJ, Zigler M, Dobroff AS,etal. Protease activated receptor-1 inhibits the maspin tumor-suppressor gene to determine the melanoma metastatic phenotype[J]. PNAS, 2011, 108(2):626-631.

[10] Zigler M, Kamiya T, Brantley EC,etal. PAR-1 and thrombin: the ties that bind the microenvironment to melanoma metastasis[J]. Cancer Res, 2011, 71(21):6561-6566.

(收稿：2016-12-12)

The expresssion of PAR1 and PAR4 in human cervical carcinoma and its clinical significance

Hou Lijuan,Zhai Jianjun.

Department of Obstetrics and Gynecology,Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University(Beijing 100176)

Objective：To investigate the mRNA expression and clinical significance of protease activated receptor1(PAR1) and protease activated receptor4(PAR4) in human cervical carcinoma. Methods：84 patients were enrolled in our study. The cervical carcinoma tissues and adjacent normal cervical tissues were collected for RT-PCR and Real-time PCR analysis. Results：The positive expression rates of PAR1 were 63.1% and 21.4% in cervical carcinoma and normal tissues, respectively(P<0.01). The positive expression rates of PAR4 were 72.6% and 29.8% in cervical carcinoma and normal tissues, respectively(P<0.01). Real-time PCR analysis showed that the 2-△Ctvalues of PAR1 were 0.61±0.15 and 0.13±0.07 in cervical carcinoma and normal tissues, respectively(P<0.01). The 2-△Ctvalues of PAR4 were 0.67±0.17 and 0.21±0.08 in cervical carcinoma and normal tissues, respectively(P<0.01). The mRNA expression of PAR1 and PAR4 was significant related with differentiation,lymphatic metastasis, and clinical pathologic stage in human cervical carcinoma(P<0.05). The mRNA expression of PAR1 was positively related to that of PAR4 (r=0.664，P<0.01). Conclusion：The overexpression of PAR1 and PAR4 have a closed relationship with the development of human cervical cancer. The combined detection of PAR1 and PAR4 might be used as the marks for estimating the prognosis of cervical carcinoma.

Uterine cervical neoplasms/pathology Receptors,proteinase-activated/analysis

子宮頸腫瘤/病理學(xué) 受體，蛋白酶激活/分析

R363

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.052

△通訊作者