免疫組化與原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)EB病毒用于診斷鼻咽癌

羅儉權(quán) 曾秀英 呂鏡雄 陳春梅 程思銳 馮天斌

免疫組化與原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)EB病毒用于診斷鼻咽癌

羅儉權(quán) 曾秀英 呂鏡雄 陳春梅 程思銳 馮天斌

目的 探析鼻咽癌診斷中檢測(cè)EB病毒更為快速及更靈敏的方法。方法 選擇2014年4月至2016年8月廣東省四會(huì)市人民醫(yī)院收治的36例鼻咽癌患者，分別采用EB病毒一抗、地高辛標(biāo)記的寡核苷酸EBER探針進(jìn)行免疫組化和原位雜交雙重標(biāo)記染色，檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞中EB病毒的表達(dá)情況。結(jié)果 免疫組化后的陽性細(xì)胞的胞膜表現(xiàn)為紅色，原位雜交后的陽性細(xì)胞胞核表現(xiàn)為藍(lán)黑色，而雙陽性細(xì)胞的核與膜呈藍(lán)紅色，不僅對(duì)比鮮明而且背景非常清晰，雙染成功后細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)完整。結(jié)論 EBER原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)EB病毒主要是檢測(cè)病毒基因，具有極高的特異性和靈敏度，比免疫組化方法更靈敏、快速，可以幫助臨床進(jìn)行鼻咽癌的分期診斷及判斷治療效果。

鼻咽癌； 病理診斷； 雙標(biāo)記原位雜交； 免疫組化

鼻咽癌是一種在我國(guó)南方地區(qū)（如廣州等）發(fā)病率非常高的惡性腫瘤，占鼻咽部惡性腫瘤的97%［1］。鼻咽癌的治療除手術(shù)外，中醫(yī)藥治療對(duì)于提高患者的生存率有很好的作用［2］。鼻咽癌又分為鱗狀細(xì)胞癌和非角化鱗癌；非角化鱗癌又分為混合型癌、圓形細(xì)胞癌（未分化型癌）及梭形細(xì)胞癌（分化型非角化鱗癌）［3-4］。我國(guó)南方地區(qū)發(fā)生的鼻咽癌95%屬于非角化鱗癌。

鼻咽癌確診前需活檢病理診斷，應(yīng)用較多的指標(biāo)是細(xì)胞角蛋白（CK）免疫組化染色。研究發(fā)現(xiàn)，EB病毒感染與鼻咽癌尤其非角化型鼻咽癌密切相關(guān)［5-6］，對(duì)于組織切片上檢測(cè)EB病毒對(duì)鼻咽癌的診斷具有重要意義。在一張切片中行免疫組化細(xì)胞角蛋白染色與EB病毒編碼的小RNA（EBER）原位雜交，雙標(biāo)記方法進(jìn)行套染，可同時(shí)分析兩種指標(biāo)在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)外鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤則屬于一種侵襲性結(jié)外淋巴瘤，形態(tài)特殊，預(yù)后差，其與EB病毒感染亦密切相關(guān)。免疫組化是傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，但這種方法不易檢測(cè)到低拷貝數(shù)RNA或DNA在細(xì)胞內(nèi)的存在［6-7］。

本研究通過分析我院收治的36例鼻咽癌患者臨床資料，比較免疫組化與原位雜交雙重標(biāo)記技術(shù)兩種方法在鼻咽癌診斷中的檢測(cè)結(jié)果，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究選用的全部標(biāo)本均取自我院2014年4月至2016年8月收治的36例鼻咽癌患者，且經(jīng)病理學(xué)診斷。病檢組織切片厚3～4 μm，用中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。實(shí)驗(yàn)所用全部試劑均由北京金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化具體步驟 將顯色后呈陽性的切片脫蠟、蒸餾水洗滌，用pH 6.0的0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（95～100 ℃）微波修復(fù)抗原15 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，然后用10%羊血清封閉孵育10 min，EB病毒單克隆抗體（單抗）工作液4 ℃過夜后PBS沖洗；37 ℃室溫孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，顯微鏡下仔細(xì)觀察顯色情況，脫水、透明、水溶性封片劑封固。

1.2.2 原位雜交雙標(biāo)記具體步驟 將3～4 μm厚的切片常規(guī)脫蠟至水，滴加100 μL蛋白酶K液，放置于60 ℃烤箱烘烤30 min，蒸餾水洗滌后無水乙醇脫水，空氣干燥。切片組織上滴加20 μL EBER探針雜交液，加上經(jīng)滅酶處理的潔凈蓋玻片，放入濕盒中37 ℃下孵育3 h；取出切片，Tris緩沖鹽溶液（TBS）沖洗3 min；滴加100 μL封閉液，室溫孵育 10 min；甩干，加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠單抗標(biāo)記物室溫孵育30 min；TBS沖洗5 min，加入5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/四唑硝基藍(lán)（BCIP/NBT）顯色液，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封固。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 送檢鼻咽黏膜表面被覆假復(fù)層纖毛柱狀上皮，固有層內(nèi)淋巴組織增生，間質(zhì)疏松水腫，伴淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分細(xì)胞明顯異型。免疫組化結(jié)果顯示：CK（+）、P63（+）、T淋巴細(xì)胞CD3（+）、B淋巴細(xì)胞CD20（+）、CD56（-）、GrB（灶狀+）、Ki67（+，20%）。見圖1。

圖1 鼻咽癌免疫組化CK陽性結(jié)果

2.2 原位雜交結(jié)果 雙染成功后細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)完整；采用免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，CK定位于細(xì)胞漿內(nèi)，陽性細(xì)胞的胞膜呈現(xiàn)紅色；采用原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示，EBER陽性反應(yīng)則定位于鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞核上，陽性細(xì)胞的胞核呈現(xiàn)藍(lán)黑色，而雙陽性細(xì)胞的核與膜呈藍(lán)紅，不僅背景非常清晰，而且對(duì)比鮮明。

圖2 原位雜交EBER檢測(cè)結(jié)果

3 討論

EB病毒感染較多的部位是人類口咽部的B淋巴細(xì)胞與上皮細(xì)胞［8］。EB病毒不僅可以感染B淋巴細(xì)胞，還可以轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，目前已發(fā)現(xiàn)的EB病毒潛伏基因表達(dá)有10余種。EBER原位雜交技術(shù)是在組織切片上檢測(cè)EB病毒敏感而有效的手段，取同一鼻咽癌組織切片，采用原位雜交與免疫組化雙重標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)CK和EB病毒，這為觀察陽性細(xì)胞是否也存在EB病毒感染提供了重要依據(jù)［9-10］。

相對(duì)EBER原位雜交技術(shù)而言，CK染色則是鼻咽癌診斷中應(yīng)用廣泛的一個(gè)免疫組化指標(biāo)。但這種方法在臨床診斷鼻咽癌病理中應(yīng)注意與淋巴瘤、鼻咽肉瘤進(jìn)行區(qū)別，淋巴瘤細(xì)胞和肉瘤細(xì)胞的CK染色表現(xiàn)為陰性時(shí)，鼻咽癌細(xì)胞CK則表現(xiàn)為陽性［11］。鼻咽上皮性病變的細(xì)胞偶爾也呈現(xiàn)CK陽性，極易誤診為鼻咽癌，但經(jīng)EB病毒檢測(cè)則呈陰性，據(jù)此可與鼻咽癌區(qū)分開。廣州等南方城市95%以上的鼻咽癌是非角化性癌，鼻咽非角化性癌中特別是鼻咽型未分化癌多是EB病毒感染所致，因而可以說，檢測(cè)組織切片EB病毒有助于鼻咽癌的病理診斷［12-13］。原位雜交技術(shù)、免疫組化染色應(yīng)用的顯色劑有多種多樣，選擇不同的顯色劑，其獲得的顏色和陽性結(jié)果均不同［14］。本研究的免疫組化結(jié)果顯示：CK（+）、P63（+）、T淋巴細(xì)胞CD3（+）、B淋巴細(xì)胞CD20（+）、CD56（-）、GrB（灶狀+）、Ki67（+，20%），與上述研究文獻(xiàn)報(bào)道一致。

雙重標(biāo)記中選用的顯色劑恰當(dāng)，可清晰對(duì)比兩種染色結(jié)果，從而便于臨床的觀察診斷。由于原位雜交技術(shù)和免疫組化兩種方法原理不同，檢測(cè)結(jié)果亦不相同。免疫組化檢測(cè)的是用EB病毒編碼的LMP-1膜蛋白，不僅價(jià)格便宜、檢測(cè)靈敏度高，而且操作方便、步驟簡(jiǎn)單，但是無法檢出EB病毒的定位及轉(zhuǎn)錄數(shù)量，因此往往作為EB病毒的初篩手段［15］。原位雜交檢測(cè)中采用的EBER-1探針，能夠探查到經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋的鼻咽癌標(biāo)本，在腫瘤細(xì)胞原位即可檢測(cè)是否存在EB病毒，不僅定位準(zhǔn)確，而且特異性強(qiáng)。此外，有時(shí)由于鼻咽癌組織中有效結(jié)合點(diǎn)減少、核酸的變性、彌散，加上組織固定又欠佳，故染色可能會(huì)呈陽性標(biāo)記弱，有時(shí)甚至假陰性。本研究中作者嘗試用EBER原位雜交檢測(cè)以及CK免疫組化檢測(cè)，AEC顯色、DAB顯色，EBER原位雜交染色結(jié)果表現(xiàn)為棕色，無彌散，也未褪色，但紅色與棕色對(duì)比效果不佳，紅色的CK不易觀察。

臨床檢測(cè)工作中，影響原位雜交雙重標(biāo)記技術(shù)和免疫組化的因素較多，要想取得最佳染色結(jié)果，作者有以下幾點(diǎn)體會(huì)： ① 由于CK的孵育時(shí)間比平時(shí)的要短些，因而顯色最好在鏡下控制，防止由于顯色過深，影響與EBER染色結(jié)果的對(duì)比。② 用EBER進(jìn)行雜交時(shí)需防止探針被RNA酶降解，操作時(shí)除嚴(yán)格遵循戴口罩、手套原則外，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備還必須經(jīng)過200 ℃烤箱過夜或焦碳酸二乙酯（DEPC）水充分浸泡。原位雜交顯色過程在4 ℃冰箱中進(jìn)行（過夜），可使顯色的過程減慢，從而減少了背景著色，充分進(jìn)行沖洗又利于減輕背景的非特異性染色。③ 原位雜交技術(shù)檢測(cè)完成后需進(jìn)行抗原修復(fù)，選擇再放入pH 8.0的Tris/EDTA緩沖液進(jìn)行中、高壓修復(fù)比應(yīng)用pH 6.0檸檬酸緩沖液或不修復(fù)效果都要更好。EBER陽性定位在細(xì)胞核，不需要復(fù)染蘇木素，以免遮蓋EBER的陽性表達(dá)。如果必須染色可淡染核固紅，此時(shí)細(xì)胞核表現(xiàn)為紅色。④ 中性樹脂中含有的二甲苯會(huì)導(dǎo)致EBER陽性顆粒彌散，從而使檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性受到影響，因而選擇水溶性封片劑封固切片較佳。封片后還應(yīng)盡早采集圖片，進(jìn)行保存，防止顯色時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致褪色。

綜上所述，EB病毒與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)，在鼻咽癌病理診斷工作中，EBER原位雜交雙標(biāo)記技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的免疫組化技術(shù)。

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（本文編輯：李銀平）

Detection value of serum retinol binding protein in diagnosis and treatment stage of diabetics with urinary tract infection

Luo Jianquan, Zeng Xiuying, Lyu Jingxiong, Chen Chunmei, Cheng Sirui, Feng Tianbin. The People's Hospital of Sihui City, Zhaoqing 526200, Guangdong, China

Corresponding author: Luo Jianquan, Email: luo3335686@163.com

Objective Investigation on a more rapid and sensitive EB virus detecting method in the diagnosis of nasopharynx cancer. Methods 36 patients with nasopharynx cancer admitted in the People's Hospital of Sihui City, Guangdong Province from April 2014 to August 2016 were selected as objects. Double labeling staining respectively were immunohistochemistry and in situ hybridization were conducted using oligonucleotides EBER probe tagged with the primary antibodies of EB virus and digoxin to detect the expression of EB virus in the nasopharynx cancer cells. Results The positive cells' membrane of immunohistochemistry was red. The positive cells' nucleus of in situ hybridization was black blue. The double positive cells' nucleus and membrane were blue red, the color contrast of which was very obvious in a very clear background. The cell and tissue structure were intact after the double labeling staining. Conclusions The technology of EBER in situ hybridization with double tags is mainly applied in the detection of virus gene and has super specificity and sensitivity. It is more sensitive and rapid than the immunohistochemistry and could contribute to the staging diagnosis and therapeutic effect determination clinically.

Nasopharyngeal carcinoma; pathological diagnosis; double labeled in situ hybridization; immunohistochemistry

廣東省肇慶市科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2016040301）

526200 廣東肇慶，廣東省四會(huì)市人民醫(yī)院

羅儉權(quán)，Email：luo3335686@163.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2017.02.005

2017-03-09）