二硫化碳染毒對大鼠腎臟的影響

瞿 力，歐三桃，賀紅焰，劉 建△

(1.重慶市第五人民醫(yī)院腎病內(nèi)科 400062；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000)

二硫化碳染毒對大鼠腎臟的影響

瞿 力1，2，歐三桃2，賀紅焰3，劉 建2△

(1.重慶市第五人民醫(yī)院腎病內(nèi)科 400062；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000)

目的 探討二硫化碳(CS2)染毒對大鼠腎臟的損害特點及其可能的發(fā)生機制。方法 80只SD大鼠隨機分為對照組(A組)及0、50、150 、250 mg/kg CS2染毒組(B、C、D、E組)，每組16只。分別在染毒12、16周末兩個時間點留取每組 6只大鼠的尿液，檢測尿蛋白/肌酐、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)；留取血液檢測腎功能；觀察各組大鼠腎臟病理改變、腎小管上皮細胞凋亡及腎臟Bax蛋白表達情況。結(jié)果 在12、16周末，大鼠尿NAG活性在各染毒組明顯增加(P<0.05)，且隨CS2染毒劑量增加而增加；尿蛋白/肌酐無明顯變化(P>0.05)。16周末血尿素氮(BUN)和肌酐水平在D、E組均升高，且E組升高更明顯(P<0.05)。HE染色結(jié)果顯示CS2染毒主要損害腎小管，呈局灶性顆?？张葑冃?，呈劑量-效益關(guān)系。腎小管上皮細胞凋亡數(shù)目隨CS2染毒劑量增加和染毒時間延長而增加，凋亡細胞在12周末時主要出現(xiàn)在近端小管上皮細胞，而16周末時則主要出現(xiàn)在遠端小管上皮細胞。免疫組化顯示隨染毒劑量增加和染毒時間延長，染毒組腎小管上皮細胞質(zhì)Bax蛋白染色程度加深及面積增大。結(jié)論 CS2染毒可導致大鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損害，細胞凋亡可能是CS2致腎臟損害的機制之一。

二硫化碳；大鼠,Sprague-Dawley；腎損害；細胞凋亡；Bax

二硫化碳(carbon disulfide,CS2)對神經(jīng)、心血管、生殖等系統(tǒng)均有毒性作用[1]，而國內(nèi)外有關(guān)CS2對腎臟毒性研究文獻報道不多，一系列流行病學調(diào)查[2-5]及動物實驗[6-9]均提示CS2對腎功能有損害且損害可能有累積作用，但未進一步闡明其損害的程度及發(fā)生機制。2014年作者收治了國內(nèi)某化纖廠10例長期接觸CS2的作業(yè)工人，腎活檢病理示腎小管損害較為突出，且部分患者腎小球呈糖尿病腎病結(jié)節(jié)樣增生改變,與2000年Klemmer等[10]報道的個案類似。本研究通過CS2腹腔染毒動物模型，探究CS2對腎臟損害的特點及其可能的機制，為防護和治療CS2中毒提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：80只雄性SD大鼠，由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供，體質(zhì)量(211.4±11.0)g。(2)主要試劑：CS2分析純由四川成都科龍化工試劑廠提供；橄欖油由西班牙品利公司提供。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)試劑盒購于北京誠林生物科技有限公司；原位末端標記(TUNEL)試劑盒購于瑞士Roche公司；Bax多克隆抗體購于美國Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 CS2染毒動物模型的建立及動物分組 將80只雄性SD大鼠分為對照組(A組)及0、50、150、250 mg/kg CS2染毒劑量組(B、C、D、E組)，每組16只。將CS2按比例溶于橄欖油中，每天腹腔注射染毒1次，每周5天，連續(xù)16周。B組予以等量的橄欖油腹腔注射，對照組不予以任何處理。于染毒12、16周末，收集尿液。然后用1%戊巴比妥鈉溶液(4 mL/kg)麻醉，迅速采血，隨之開腹，迅速取出腎臟組織并稱質(zhì)量，測定腎臟指數(shù)[腎臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(kg)]，將腎臟置于4%多聚甲醛液中固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2.2 尿蛋白/肌酐的測定 采用考馬斯亮藍比色法測定尿蛋白水平，苦味酸法測定尿肌酐。

1.2.3 尿NAG及腎功能檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠尿樣中NAG的活性，腎功能的檢測采用全自動生化分析儀檢測。

1.2.4 HE染色光鏡檢查 大鼠腎臟組織石蠟切片，行HE染色，光鏡下觀察腎組織的病理改變。

1.2.5 腎小管上皮細胞凋亡的檢測 采用TUNEL法，按試劑盒(Roche)的操作說明，常規(guī)石蠟包埋切片預處理后，加入蛋白酶K溶液，于室溫水解30 min，1.8%過氧化氫封閉。在切片上加20～50 μL Tunel反應混合物，于37 ℃反應60 min，中性樹膠封片。

1.2.6 腎組織Bax蛋白免疫組織化學檢測 石蠟切片常規(guī)脫蠟，入水后經(jīng)一抗Bax多克隆抗體的酶標親和素-生物素復合物法(SP法)免疫組織化學染色，DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。細胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒者為Bax蛋白陽性表達，采用圖像分析軟件Image-Pro-Plus 6.0(IPP 6.0)進行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠存活率和一般狀況比較 染毒16周末，A、B、C、D、E組組存活率分別為100.00%、100.00%、87.50%、81.30%、75.00%。最終每組12只大鼠用于實驗，12、16周末每組各6只。A、B組大鼠活動正常；各染毒組大鼠染毒早期主要表現(xiàn)為活動增多、攻擊性強等；中期主要表現(xiàn)為興奮性下降，隨之毛發(fā)蓬亂而無光澤，肌張力下降，步態(tài)異常等；染毒結(jié)束時C組大鼠表現(xiàn)為后肢無力，E組則出現(xiàn)明顯的步態(tài)異常，D組介于上述兩組之間。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)比較±s，n=6)

a：P<0.05，與A、B組同期比較；b：P<0.05，與C組同期比較。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、腎臟指數(shù)、尿液指標及腎功能比較 與A、B組大鼠同時間點比較，12、16周末D、E組大鼠體質(zhì)量明顯下降而腎臟指數(shù)明顯增加，E組變化最明顯(P<0.05)；與C組上述指標比較，E組體質(zhì)量下降及腎臟指數(shù)增加明顯(P<0.05)，見表1。各染毒組尿NAG活性明顯增加，且隨染毒劑量增加呈增加趨勢(P<0.05)；各染毒組大鼠尿量及尿蛋白/肌酐水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。各組大鼠12周末血清Scr和BUN水平變化不明顯(P>0.05)；16周末D、E組BUN、Scr升高明顯，且E組升高最明顯(P<0.05)；各染毒組大鼠UA水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表2 各組大鼠尿液指標比較

a：P<0.05，與A、B組同期比較；b：P<0.05，與C組同期比較;c:P<0.05，與D組同期比較。

2.3 各組大鼠腎組織HE染色結(jié)果比較 A、B組大鼠腎小球及腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整，無明顯病理改變；12周末C、D組大鼠腎組織未見明顯損傷，E組可見輕度的腎小管上皮細胞局灶性顆粒空泡變性。16周末隨CS2染毒劑量的增加，C、D、E組出現(xiàn)不同程度的腎小管上皮細胞局灶性顆粒空泡變性。

表3 各組大鼠腎功能相關(guān)指標比較±s，n=6)

a：P<0.05，與A、B組同期比較；b：P<0.05，與C組同期比較。

a：P<0.05，與A、B組同時間點比較；b：P<0.05，與C組同時間點比較；c：P<0.05，與D組同時間點比較。

圖1 各組大鼠腎細胞凋亡指數(shù)比較

2.4 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)比較 A、B組可見少量凋亡細胞，同一時間C、D、E組隨CS2染毒劑量增加，細胞核可見呈棕褐色的凋亡細胞，凋亡細胞數(shù)目明顯增多(P<0.05)。其中，凋亡細胞主要表達于腎小管，12周末染毒組凋亡細胞主要位于近端小管上皮細胞；16周末時染毒組主要表達于遠端小管上皮細胞核。各組大鼠腎細胞凋亡情況，見圖1。

圖2 各組大鼠腎組織Bax的表達(免疫組化×200)

2.5 各組大鼠腎組織 Bax蛋白的表達比較 A、B組大鼠的腎組織中基本上未見Bax陽性細胞。在同一時間時，C、D、E組Bax陽性細胞主要表達于近端小管上皮細胞。C、D、E組Bax蛋白的平均光密度值比A、B組明顯增多(P<0.05)，且E組值最大(P<0.05)，C組值最小，D組介于二者之間。各組大鼠腎組織Bax的表達，見圖2。

3 討 論

CS2職業(yè)中毒主要通過呼吸道，但動物經(jīng)吸入染毒引發(fā)的腎臟損害一般較輕，并且具有難以控制染毒劑量，染毒設(shè)備要求高等缺點。灌胃染毒主要損傷肝臟[11]，CS2經(jīng)腹腔染毒后，在體內(nèi)吸收快，生物利用度高。由于造成CS2作業(yè)工人損害的主要是慢性低濃度中毒[4-5，12]，因此本研究在前期預實驗的基礎(chǔ)上，選擇CS250、150、250 mg/kg 3個染毒劑量組，通過改變?nèi)径痉绞郊把娱L染毒時間對大鼠染毒，進一步探索CS2對腎臟的損害作用。

本研究結(jié)果顯示，在其他腎功能指標無明顯異常時，各染毒組尿NAG明顯增加，并呈現(xiàn)劑量-效益關(guān)系，提示CS2慢性染毒可致大鼠腎臟損害，且以損害近端小管上皮細胞主。在12、16周末，尿蛋白/肌酐隨染毒劑量增加變化不顯著，提示大鼠腎近端小管上皮細胞有一定損傷，但尚未影響其腎小球功能，與陳炯等[9]研究結(jié)果相似。CS2導致的腎臟損害中，尿NAG改變較尿蛋白/肌酐明顯，表明腎小管受損早于小球，且比腎小球更加敏感。與病理形態(tài)學上腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，腎組織的病理損傷主要在腎近端小管上皮細胞，并隨染毒劑量增加和染毒時間延長，病理改變越重相吻合。與文獻[13-14]的研究結(jié)果相似。在延長染毒時間及增加染毒劑量情況下，動物實驗仍未出現(xiàn)類似人體CS2中毒的腎小球病變(類糖尿病腎病的結(jié)節(jié)樣增生)[10,15]，推測CS2導致的腎臟損害可能存在種屬差異。

本實驗中發(fā)現(xiàn)C、D、E組腎臟細胞凋亡數(shù)目明顯增多，說明腎組織中存在細胞凋亡。Bax蛋白表達明顯增加，且在不同染毒組Bax蛋白表達的強度存在差異，說明腎臟受損可能是通過調(diào)節(jié)Bax蛋白表達量來調(diào)節(jié)大鼠腎臟細胞凋亡數(shù)目的。16周末時CS2染毒組近端小管上皮細胞Bax表達明顯，可能是CS2產(chǎn)生過多的自由基，促進Bax表達升高，從而誘導了線粒體途徑的凋亡。但12周末時Bax表達不明顯，可見腎臟損害尚處于早期，其引起的細胞凋亡還未進入終末階段。進一步實驗結(jié)果表明，CS2染毒組12周末時凋亡細胞出現(xiàn)在近端小管上皮細胞，而16周末時在遠端小管，與Bax蛋白的表達不一致?？赡苁荰UNEL表達主要在凋亡的早期階段，而Bax顯示的是凋亡的終末執(zhí)行階段。上述結(jié)果提示CS2誘導的腎臟損害早期在近端小管，逐漸發(fā)展到遠端小管，但不能排除非線粒體及其他途徑所致早期損傷凋亡，有待進一步的實驗驗證。

CS2致腎臟損害的機制目前尚不完全清楚，本研究結(jié)果表明在CS2中毒性腎病中細胞凋亡起重要作用，細胞凋亡相關(guān)基因Bax可能參與了腎臟損害的病理過程。這為臨床上職業(yè)性CS2中毒相關(guān)性腎病的發(fā)病機制提供了新的思路和實驗理論依據(jù)。

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瞿力(1988-)，住院醫(yī)師，碩士研究生，主要從事腎小球疾病基礎(chǔ)與臨床的研究?！?/p>

，E-mail:liujianhhy@sina.com。

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.035

R595.9

B

1671-8348(2017)18-2551-04

2017-01-12

2017-03-16)