甘藍(lán)型油菜EMS突變后代材料的分子遺傳多樣性分析

袁潤勤，曲高平，郭 媛，胡勝武

(1.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

甘藍(lán)型油菜EMS突變后代材料的分子遺傳多樣性分析

袁潤勤1,2，曲高平1,2，郭 媛1,2，胡勝武1,2

(1.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

旨在利用SSR和SRAP標(biāo)記從分子水平上分析甘藍(lán)型油菜EMS突變后代材料的遺傳差異。選取138個(gè)‘中雙9號’油菜的EMS突變M3株系(以‘中雙9號’為參照)，這些材料的葉、花、角果等存在豐富的形態(tài)學(xué)變異，選用24對擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高的SRAP引物和20對SSR引物對參試的139個(gè)材料進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，24對SRAP引物共檢測到360個(gè)位點(diǎn)，其中102個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)，平均多態(tài)性比率為28.33%，平均多態(tài)性信息含量PIC為0.60；20對SSR引物共檢測到196個(gè)位點(diǎn)，其中91個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)，平均多態(tài)性比率為46.43%，PIC為0.59。參試材料之間的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.91，聚類分析和群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，參試EMS突變M3株系沒有完全按表型突變聚在一起。研究表明，EMS誘導(dǎo)‘中雙9號’產(chǎn)生了分子水平上可檢測的突變且誘變后代材料之間存在廣泛的遺傳差異。

甘藍(lán)型油菜；EMS突變后代材料；遺傳多樣性；SSR標(biāo)記；SRAP標(biāo)記

甲基磺酸乙酯(Ethyl methyl sulfonate，EMS)是作物誘變育種中利用最廣泛、效果最好的一種化學(xué)誘變劑[1]。迄今為止，通過化學(xué)誘變育成406個(gè)作物品種，其中EMS誘變育成的品種有116個(gè)，占化學(xué)誘變育成品種的28.6%(http://mvgs.iaea.org/)。甘藍(lán)型油菜是一個(gè)比較年輕的物種，近代油菜品質(zhì)育種(低芥酸、低硫甙)使其經(jīng)歷了2次瓶頸，導(dǎo)致其遺傳基礎(chǔ)進(jìn)一步狹窄[2]。通過EMS等誘變處理，是創(chuàng)造油菜新變異、豐富油菜資源的一條重要途徑。前人以不同油菜品種為基礎(chǔ)材料，通過EMS誘變創(chuàng)建了幾個(gè)油菜突變體庫[3-6]，并對突變材料的形態(tài)特征、植物學(xué)性狀及品質(zhì)等進(jìn)行了鑒定分析，這些突變體的獲得拓寬了油菜遺傳變異。

分子標(biāo)記具有穩(wěn)定性強(qiáng)、不受環(huán)境條件的影響、沒有組織或器官的特異性、不受個(gè)體發(fā)育階段的影響等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于作物遺傳育種研究。目前，利用SSR分子標(biāo)記對玉米[7-8]、小麥[9]、大豆[10]等作物EMS突變后代材料進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)不同誘變系間存在一定的遺傳變異，且這些變異與品質(zhì)性狀、農(nóng)藝性狀相關(guān)。這些研究結(jié)果為突變體的利用提供了參考依據(jù)。然而，目前還未見對油菜EMS突變體后代的分子遺傳多樣性研究的報(bào)道。

西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜研究中心生物技術(shù)育種課題組利用體積分?jǐn)?shù)為1.0% 的EMS溶液處理‘中雙9號’油菜干種子，創(chuàng)建了包括子葉、葉片、花器、株型、角果等多器官變異類型的突變體庫[6]。本研究從該突變體庫M2代2 558個(gè)株系中選擇138個(gè)不同變異類型材料，種成M3株系，利用SSR和SRAP標(biāo)記對這138個(gè)M3代株系和基礎(chǔ)材料‘中雙9號’(對照)進(jìn)行遺傳多樣性評價(jià)，為這些材料在油菜遺傳育種中的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

利用體積分?jǐn)?shù)為1.0% EMS溶液處理甘藍(lán)型油菜‘中雙9號’干種子，得到一個(gè)變異類型比較豐富的突變體庫。從該突變體庫M2代2 558個(gè)株系中選擇138個(gè)不同變異類型材料，種成M3株系。這些材料表現(xiàn)出較為廣泛的變異，包括25個(gè)不育材料，13個(gè)花色突變材料，5個(gè)花閉合材料，3個(gè)無雌蕊突變材料，9個(gè)花瓣突變材料，6個(gè)其他花變異；3個(gè)葉片內(nèi)卷材料，22個(gè)葉色突變材料；15個(gè)角果突變材料；17個(gè)種子突變材料；5個(gè)株型突變材料；還有15個(gè)其他類型突變材料(表1)。以基礎(chǔ)材料‘中雙9號’油菜為對照，進(jìn)行觀察和分析。

表1 突變材料及其典型特征Table 1 The characteristics of rapeseed mutants

(續(xù)表1 Continued table 1)

編號Code表型Phenotype突變類型Mutationtype編號Code表型Phenotype突變類型Mutationtype編號Code表型Phenotype突變類型Mutationtype26不育Sterility花突變Flowermutation73葉片黃化Etiolatedleaf葉突變Leafmutation121紫株P(guān)urpleplant株型突變Plantmutation27不育Sterility花突變Flowermutation74葉片黃化Etiolatedleaf葉突變Leafmutation122褐籽Brownseed種子突變Seedmutation28不育Sterility花突變Flowermutation75葉片黃化Etiolatedleaf葉突變Leafmutation123角果紫Purplesilique角果突變Siliquemutation29不育Sterility花突變Flowermutation76黃化-白化Etiolated-albinistcleaf葉突變Leafmutation124角果紫Purplesilique角果突變Siliquemutation30不育Sterility花突變Flowermutation78邊緣黃化Etiolatedofleafedge葉突變Leafmutation125角果紫Purplesilique角果突變Siliquemutation31不育Sterility花突變Flowermutation79葉片黃化Etiolatedleaf葉突變Leafmutation127紫株P(guān)urpleplant株型突變Plantmutation32不育Sterility花突變Flowermutation80淺綠Lightgreenleaf葉突變Leafmutation128柱頭外露Stigmashowing花突變Flowermutation33葉片內(nèi)卷Involuteleaf葉突變Flowermutation81邊緣黃化Etiolatedofleafedge葉突變Leafmutation129墨綠葉Blackishgreenleaf葉突變Leafmutation34葉片內(nèi)卷Involuteleaf葉突變Flowermutation82不完全黃化Notcompletelyetiolatedleaf葉突變Leafmutation130葉片黃化Etiolatedleaf葉突變Leafmutation35葉片內(nèi)卷Involuteleaf葉突變Flowermutation83葉片黃化Etiolatedleaf葉突變Leafmutation131花枝異化Sprayalienation花突變Flowermutation36花色淺Flowerwithlightcolor花突變Flowermutation84葉片黃化Etiolatedleaf葉突變Leafmutation132叢生Caespitosebranches株型突變Plantmutation37花色淺Flowerwithlightcolor花突變Flowermutation85不完全黃化Notcompletelyetiolatedleaf葉突變Leafmutation133其他類型Othertype38花色淺Flowerwithlightcolor花突變Flowermutation86淺綠Lightgreenleaf葉突變Leafmutation134其他類型Othertype39花色淺Flowerwithlightcolor花突變Flowermutation87葉片黃化Etiolatedleaf葉突變Leafmutation135其他類型Othertype40花色淺Flowerwithlightcolor花突變Flowermutation88邊緣黃化Etiolatedofleafedge葉突變Leafmutation136其他類型Othertype41花色白Whiteflower花突變Flowermutation89黃籽Yellowseed種子突變Seedmutation137其他類型Othertype42花色白Whiteflower花突變Flowermutation90黃籽Yellowseed種子突變Seedmutation138其他類型Othertype43花色白Whiteflower花突變Flowermutation91黃籽Yellowseed種子突變Seedmutation139其他類型Othertype44花色白Whiteflower花突變Flowermutation92黃籽Yellowseed種子突變Seedmutation140其他類型Othertype45花色白Whiteflower花突變Flowermutation93黃籽,角果粗短Yellowseed,dumpysilique種子突變Seedmutation141其他類型Othertype46花色白Whiteflower花突變Flowermutation94黃籽Yellowseed種子突變Seedmutation142其他類型Othertype47花色白Whiteflower花突變Flowermutation95黃籽Yellowseed種子突變Seedmutation143中雙9號ZhongshuangNo.9突變基礎(chǔ)材料Wildtype48花色白Whiteflower花突變Flowermutation96黃籽Yellowseed種子突變Seedmutation49多花叢生Twoflowerswithonestalk花突變Flowermutation97黃籽Yellowseed種子突變Seedmutation

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取 從每個(gè)M3株系中隨機(jī)選取5個(gè)單株，每個(gè)單株取等量嫩葉混合，按照Murray等[11]報(bào)道的改良CTAB法提取總基因組DNA。

1.2.2 SRAP-PCR SRAP引物參照Li等[12]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，34條上游引物和19條下游引物隨機(jī)組合成646對引物組合，從中篩選出擴(kuò)增條帶豐富、清晰、穩(wěn)定的24對引物組合用于對所有參試材料的擴(kuò)增分析。PCR及產(chǎn)物檢測：PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中模板DNA(50 ng/μL)2 μL、ddH2O 2.4 μL、SRAP正反向引物各0.3 μL、2× EsTaqDNA Polymerase(康為世紀(jì)生產(chǎn))5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min， 5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min， 35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用80 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.3 SSR-PCR 從380對引物中篩選出20對擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定的多態(tài)性引物并用于對所有參試材料的擴(kuò)增分析。PCR及產(chǎn)物檢測：PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中模板DNA(50 ng/μL)2 μL、ddH2O 2.4 μL、SSR正反向引物各0.3 μL、2×EsTaqDNA Polymerase(康為世紀(jì)生產(chǎn))5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度下降0.5 ℃；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸4 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用80 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

根據(jù)0、1矩陣，利用NTSYSpc 2.0軟件[13]中的子程序SHAN程序和UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，對139個(gè)材料構(gòu)建聚類圖；采用NTsys-pc 2.0軟件的Dice計(jì)算參試材料的遺傳相似系數(shù)(GS)，遺傳距離(GD)=1-GS。利用Structure 2.3.4[14]軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 參試材料的SRAP和SSR分析

從646個(gè)SRAP引物組合中篩選出多態(tài)性高、條帶清晰、重復(fù)性好的24對引物對參試的138個(gè)M3株系及‘中雙9號’(對照)進(jìn)行分析。結(jié)果共擴(kuò)增出360個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶102個(gè)，平均每對引物組合檢測到4.25個(gè)多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性比率為28.33%。在選用的24對引物組合中，引物組合Em15+Me11擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)最多(10)，引物組合Em11+Me21為單態(tài)位點(diǎn)，各對引物可擴(kuò)增出1～10個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。SRAP引物組合PIC為0.17(Em14+Me23)～0.85(Em15+Me11)，平均為0.60(表2)。

從380對SSR引物中篩選出20對擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的多態(tài)性引物，用于138個(gè)M3株系及‘中雙9號’(對照)遺傳多樣性分析。結(jié)果共擴(kuò)增得到196個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)91個(gè)，平均4.55個(gè)，平均多態(tài)性比率為46.43%。選用的20對引物可擴(kuò)增出2～8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中引物CB10028擴(kuò)增到8個(gè)，引物Ni4-C06和引物Na14-D07僅擴(kuò)增出2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。SSR引物組合PIC為0.21(Ni4-D09)～0.80(CB10028)，平均為0.59(表3)。

2.2 聚類分析

基于SRAP和SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)，139個(gè)材料兩兩組合共得到9 591個(gè)遺傳相似系數(shù)，138個(gè)誘變材料與基礎(chǔ)材料‘中雙9號’的遺傳相似系數(shù)為0.50～0.82，平均為0.70。將遺傳相似系數(shù)轉(zhuǎn)化為遺傳距離，以0.02為組距進(jìn)行次數(shù)分布分析，139個(gè)試驗(yàn)材料間的遺傳距離為0.09～0.52，平均為0.29，其中No.33和No.20，No.108和No.20遺傳距離最大，為0.52；No.46和No.40，No.41和No.46，No.63和No.85，No.80和No.85，No.121和No.130，No.130和No.131間的遺傳距離最小，為0.09。84%的遺傳距離數(shù)據(jù)集中分布在0.21～0.37，遺傳距離小于0.21有699個(gè)(7.3%)，遺傳距離大于0.37有840個(gè)(8.7%)。97% 的遺傳距離分布在0.17～0.42(圖1)。

根據(jù)SRAP和SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)，利用UPGMA方法構(gòu)建聚類圖(圖2)。結(jié)果139個(gè)材料被分為5類(Cluster Ⅰ-V)：Cluster Ⅰ由44個(gè)材料組成，其中25個(gè)花突變材料，12個(gè)葉突變材料，5個(gè)種子突變材料，1個(gè)角果突變材料和基礎(chǔ)材料‘中雙9號’；44個(gè)材料間的遺傳相似系數(shù)為0.74～0.91。Cluster Ⅱ由32個(gè)材料組成，其中4個(gè)花突變材料，2個(gè)葉突變，8個(gè)種子突變材料，9個(gè)角果突變材料，3個(gè)株型突變材料，6個(gè)其他類型突變材料；32個(gè)材料間的遺傳相似系數(shù)為0.73～0.91。Cluster Ⅲ由8個(gè)材料組成，其中3個(gè)花突變材料，1個(gè)葉突變材料，2個(gè)種子突變材料，1個(gè)角果突變材料，1個(gè)其他類型材料；8個(gè)突變材料的遺傳相似系數(shù)為0.73～0.85。Cluster Ⅳ由40個(gè)突變材料組成，其中21個(gè)花突變材料，7個(gè)葉突變材料，2個(gè)種子突變材料，1個(gè)角果突變材料，2個(gè)株型突變材料，7個(gè)其他類型材料；40個(gè)突變材料間的遺傳相似系數(shù)為0.67～0.88。Cluster Ⅴ包括15個(gè)突變材料，其中8個(gè)花突變材料，3個(gè)葉突變材料，3個(gè)角果突變材料， 1個(gè)其他類型突變材料；這15個(gè)突變材料的遺傳相似系數(shù)為0.62～0.75。所有供試的138個(gè)突變材料沒有按照葉突變、花突變、角果突變、種子突變、株型突變和其他突變類型聚類。

表2 SRAP引物組合及擴(kuò)增結(jié)果Table 2 The SRAP primer combinations and their amplified results

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)SRAP和SSR擴(kuò)增結(jié)果，利用STRUCURE 2.2軟件對139個(gè)材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)不同k值所對應(yīng)的LnP(D)值，發(fā)現(xiàn)k=5時(shí)出現(xiàn)拐點(diǎn)，因此將139個(gè)材料分為5個(gè)組(GⅠ～GⅤ，圖3)。GⅠ包括44個(gè)突變材料,其中23個(gè)花突變材料，13個(gè)葉突變材料，5個(gè)種子突變材料，1個(gè)角果突變材料，1個(gè)株型突變材料，和基礎(chǔ)材料‘中雙9號’；包括聚類分析Cluster Ⅰ中38個(gè)突變材料和基礎(chǔ)材料‘中雙9號’，Cluster Ⅱ中2個(gè)突變材料，Cluster Ⅲ中1個(gè)突變材料，Cluster Ⅳ中2個(gè)突變材料。G Ⅱ包括16個(gè)突變材料，其中5個(gè)花突變材料，3個(gè)葉突變材料，3個(gè)角果突變材料，2個(gè)株型突變材料，3個(gè)其他類型突變材料；包括聚類分析Cluster Ⅳ中5個(gè)突變材料，Cluster Ⅴ中11個(gè)突變材料。G Ⅲ包括14個(gè)材料，其中4個(gè)花突變材料，5個(gè)葉突變材料，2個(gè)種子突變材料，1角果突變材料，2個(gè)其他類型突變材料；包括聚類分析Cluster Ⅲ中的7個(gè)突變材料，Cluster Ⅳ中的4個(gè)材料，Cluster Ⅴ中的3個(gè)突變材料。G Ⅳ包括33個(gè)材料，其中4個(gè)花突變材料，1個(gè)葉突變材料，9個(gè)種子突變材料，10個(gè)角果突變材料， 2個(gè)株型突變材料，7個(gè)其他類型的突變材料；包括聚類分析Cluster Ⅱ中的30個(gè)突變材料，Cluster Ⅳ中的3個(gè)突變材料。G Ⅴ包含32個(gè)突變材料，包括25個(gè)花突變材料，3個(gè)葉突變材料，1個(gè)種子突變材料，3個(gè)其他類型突變材料；包括聚類分析Cluster Ⅰ中的5個(gè)突變材料，Cluster Ⅳ中的26個(gè)突變材料，Cluster Ⅴ中的1個(gè)突變材料。總體來看，群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致，但供試的突變材料還是沒有按照葉突變、花突變、角果突變、種子突變、株型突變和其他突變類型聚類。

表3 SSR引物信息、擴(kuò)增帶數(shù)、多態(tài)性帶數(shù)和PICTable 3 The PIC, total and polymorphic fragments per SSR primer

圖1 試驗(yàn)材料間遺傳距離次數(shù)分布直方圖Fig.1 The frequency distribution of genetic distance between experimental materials

突變類型中紫色為花突變材料 Purple flower mutation；橙色為葉突變材料 Orange leaf mutation；淺藍(lán)色為種子突變 Light blue seed mutation；深綠色為角果突變 Dark green silique mutation；灰色為株型突變材料 Gray plant type mutation；深紅色為其他類型 Dark red other types of mutation

圖2 基于 SRAP和SSR分子標(biāo)記構(gòu)建的139份試驗(yàn)材料的聚類圖
Fig.2 Dendrogram of 139 materials generated by SSR and SRAP molecular markers

5種顏色代表5個(gè)組(GⅠ～GⅤ) Five colors represent five inferred groups；每個(gè)柱代表一個(gè)突變體 Each bar represents each accession；圖中數(shù)字為材料編號 The numbers under each bar are the accession numbers as in table 1；每個(gè)柱中，不同顏色占柱的百分比，代表突變體遺傳物質(zhì)在該顏色所示組中的比例 The estimated genetic fraction of each accession of each inferred group was indicated in different colors.

圖3 SSR和SRAP標(biāo)記構(gòu)建的139份試驗(yàn)材料的群體結(jié)構(gòu)圖(k=5)
Fig.3 Population structure of the 139 materials by SSR and SRAP molecular markers(k=5)

3 討 論

與蕓薹屬其他物種相比，甘藍(lán)型油菜遺傳背景狹窄、遺傳基礎(chǔ)單一[15]。因此，利用理化誘變創(chuàng)造油菜新變異，拓寬其遺傳基礎(chǔ)，對豐富現(xiàn)有油菜資源具有非常重要的意義。本課題組利用體積分?jǐn)?shù)為0.1% EMS溶液處理‘中雙9號’油菜干種子，構(gòu)建甘藍(lán)型油菜EMS突變體庫[6]，創(chuàng)造了新的種質(zhì)資源，分析這些新種質(zhì)的分子遺傳多樣性對其在油菜育種中的合理利用具有指導(dǎo)意義。

本研究利用SRAP和SSR標(biāo)記分析結(jié)果表明，138個(gè)EMS誘變M3株系與基礎(chǔ)材料‘中雙9號’的遺傳相似系數(shù)為0.50～0.82，平均為0.70。Girija等[16]分別用EMS、γ射線、EMS-γ射線誘導(dǎo)豇豆品種‘CO7’，用RAPD標(biāo)記分析M6代遺傳差異，結(jié)果顯示誘變材料與基礎(chǔ)材料的遺傳相似系數(shù)為0.58～0.71，平均為0.66。李紅英等[17]用SSR標(biāo)記分析玉米自交系A(chǔ)S-9經(jīng)化學(xué)誘變獲得的誘變系M1和M4的遺傳差異，研究表明誘變系M1和M4與基礎(chǔ)材料的遺傳相似系數(shù)分別為0.32～0.41、0.38～0.48，平均值分別為0.36、0.43。石海春等[7]用EMS-石蠟誘變玉米自交系K305和R08，并用SSR標(biāo)記分析9個(gè)K305誘變系和10個(gè)R08誘變系的遺傳差異，結(jié)果顯示，K305誘變系與K305的遺傳相似系數(shù)為0.79～0.92，平均為0.86，R08誘變系與R08的遺傳相似系數(shù)為0.71～0.88，平均為0.81。張娜等[18]用EMS處理燕麥品種‘白燕2號’，并分析M2突變體的遺傳多樣性，結(jié)果顯示突變體間的遺傳相似系數(shù)為0.67～0.97。上述結(jié)果表明， EMS誘變不同作物產(chǎn)生了分子水平上可檢測到的變異，但變異范圍因作物及誘變處理不同而異。

基于SRAP和SSR標(biāo)記結(jié)果對139個(gè)參試材料進(jìn)行聚類分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示138個(gè)突變體并沒有按照突變表型而明顯地聚在一起。一方面，不同基因突變可能導(dǎo)致同樣的表型，例如前人在擬南芥中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了多種雄性不育，研究發(fā)現(xiàn)它們受控于不同的基因[19-23]；另一方面，筆者在對突變體進(jìn)行表型觀察記載時(shí)，主要選取最明顯直觀的表型變異，但突變體間還存在其他變異，只是認(rèn)為其應(yīng)用價(jià)值不大或忽略記載。因此，導(dǎo)致EMS突變后代沒按花、葉、種子、角果、株型突變等聚在一起。建議選擇與基礎(chǔ)材料遺傳相似系數(shù)較小的突變材料進(jìn)行深入研究，可望為油菜遺傳改良提供變異更加豐富的材料。

Reference：

[1] 劉 翔.EMS誘變技術(shù)在植物育種中的研究進(jìn)展[J].激光生物學(xué)報(bào),2014(3):197-201.

LIU X.Progresses on EMS mutagenesis in plant breeding[J].ActalaserBiologySinica,2014(3):197-201(in Chinese with English abstract).

[2] BUS A,KORBER N,SNOWDONR J,etal.Patterns of molecular variation in a species-wide germplasm set ofBrassicanapus[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2011,123(8):1413-1423.

[3] 孫加焱,涂進(jìn)東,范叔味,等.甘藍(lán)型油菜理化誘變和突變體庫的構(gòu)建[J].遺傳,2007,29(4):475-482.

SUN J Y,TU J D,FAN SH W,etal.The screening of mutants induced by physical and chemical factors and construction of mutant population forBrassicanapusL.[J]Heredotas,2007,29(4):475-482(in Chinese with English abstract).

[4] 汪 念.甘藍(lán)型油菜EMS突變體庫的構(gòu)建及TILLING、EcoTILLING技術(shù)的應(yīng)用研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

WANG N.Constructing an EMS mutant population and applicating TILLING,EcoTILLING technology inBrassicanapus[D].Wuhan：Huazhong Agriculture University,2009(in Chinese with English abstract).

[5] 石從廣,孟華兵,姜宇曉,等.甘藍(lán)型油菜EMS誘變二代農(nóng)藝與籽粒品質(zhì)性狀的變異與TILLING庫的構(gòu)建[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2010,24(6):1132-1140.

SHI C G,MENG H B,JIANG Y X ,etal.Phenotypic variation of agronomic and grain quality traits in an EMS-induced M2population and the construction of the DNA pool for TILLING analysis[J].JournalofNuclearAgriculturalSciences,2010，24(6)：1132-1140(in Chinese with English abstract).

[6] 曲高平,孫妍妍,龐紅喜,等.甘藍(lán)型油菜EMS突變體庫構(gòu)建及抗除草劑突變體篩選[J].中國油料作物學(xué)報(bào),2014,36(1)：25-31.

QU G P,SUN Y Y,PENG H X,etal.EMS mutagenesis and ALS-inhibitor herbicide-resistant mutants ofBrassicanapusL.[J].ChineseJournalofOilCropSciences,2014,36(1)：25-31(in Chinese with English abstract).

[7] 石海春,譚義川,夏 偉,等.19份玉米EMS誘變系的遺傳差異評價(jià)[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2016,31(1):110-116.

SHI H CH,TAN Y CH,XIA W,etal.Evaluation on genetic differences of 19 maize mutant lines induced by EMS[J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica,2016,31(1):110-116(in Chinese with English abstract).

[8] 覃鴻妮,蔡一林,楊春蓉,等.玉米誘變系的SSR遺傳變異分析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2008(6):750-755,765.

QIN H N,CAI Y L,YANG CH R,etal.Genetic variation of maize(ZeamaysL.) mutants based on SSR analysis[J].JournalofNuclearAgriculturalSciences,2008(6):750-755,765(in Chinese with English abstract).

[9] 王長里.EMS誘導(dǎo)小麥M2代突變的鑒定[D].河北保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

WANG CH L.Identification of wheat M2mutations induced by EMS [D].Baoding Hebei:Agricultural University of Hebei,2008(in Chinese with English abstract).

[10] 謝圣男,王宏光,楊 振,等.大豆綏農(nóng)14突變體庫構(gòu)建及株高性狀分析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2013,27(3):307-313.

XIE SH N,WANG H G,YANG ZH ,etal.Construction of Suinong 14 mutant library and analysis of soybean height mutant[J].JournalofNuclearAgriculturalSciences,2013,27(3):307-313(in Chinese with English abstract).

[11] MURRAY M G,THOMPSON W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA [J].NucleicAcidsResearch,1980,8(19)：4321-4325.

[12] LI G,QUIROS C F.Sequence-related amplified polymorphism(SRAP)a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging inBrassica[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2001,103(2):455-461.

[13] ROHLF F J.Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System Version 2.0 User Guide[M].Exeter Software Setauket,New York:1998.

[14] PRITCHARD J K,STEPHENS M,DONNELLY P.Inference of population structure using multilocus genotype data[J].Genetics,2000,7(4):574-578.

[15] 伍曉明,許 鯤,王漢中,等.甘藍(lán)型油菜與新疆野生油菜屬間雜種的獲得與分子鑒定[J].中國油料作物學(xué)報(bào),2002,24(4):5-9.

WU X M,XU K,WANG H ZH,etal.Obtained and molecular identification of interspecific hybrids betweenBrassicaand Xinjiang wild rape[J].ChineseJournalofOilCropSciences,2002,24(4):5-9(in Chinese).

[16] GIRIJA M,GNANAMURTHY S,DHANAVEL D.Genetic diversity analysis of cowpea mutant (VignaunguiculataL. Walp) as revealed by RAPD marker [J].InternationalJournalofAdvancedResearch,2013,1(4):139-147.

[17] 李紅英,盧存福,蘭小中,等.玉米自交系A(chǔ)S-9化學(xué)誘變后代SSR遺傳變異分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2013,28(3):92-101.

LI H Y,LU C F,LAN X ZH,etal.Genetic variation analysis in maize mutants from AS-9 inbread line based on SSR marker[J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica,2013,28(3):92-101 (in Chinese with English abstract).

[18] 張 娜,楊希文,任長忠,等.白燕2號EMS突變體的形態(tài)鑒定與遺傳變異分析[J].麥類作物學(xué)報(bào),2011,31(3):421-426.

ZHANG N,YANG X W,REN CH ZH,etal.Morphological identification and genetic variation analysis of EMS mutants from Hexaploid Oat (Avenasativa) cultivar Baiyan2[J].JournalofTriticeaeCrops,2011,31(3):421-426 (in Chinese with English abstract).

[19] AARTS M G,DIRKSE W G,STIEKEMA W J,etal.Transposon tagging of a male sterility gene inArabidopsis[J].Nature,1993,363(6431):715-717.

[20] SANDERS P M,WETERINGS B K.Anther developmental defects inArabidopsisthalianamale-sterile mutants[J].SexualPlantReproduction,1998,11(6):297-322.

[21] WILSON Z A,MORROLL S J,SWARUP R,etal.TheArabidopsisMALE STERILITY1 (MS1) gene is a transcriptional regulator of male gametogenesis,with homology to the PHD-finger family of transcription factors[J].PlantJournal,2001,28(1):27-39.

[22] STEINER-LANGE S,UNTE U S,ECKSTEIN L,etal.Disruption ofArabidopsisthalianaMYB26 results in male sterility due to non-dehiscent anthers.[J].PlantJournal,2003,34(4):519-528.

[23] ARIIZUMI T,HATAKEYAMA K,HINATA K R,etal.Disruption of the novel plant protein NEF1 affects lipid accumulation in the plastids of the tapetum and exine formation of pollen,resulting in male sterility inArabidopsisthaliana[J].PlantJournal,2004,39(2):170-181.

(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Molecular Genetic Diversity in EMS-induced Mutant Progenies inBrassicanapusL.

YUAN Runqin1,2，QU Gaoping1,2，GUO Yuan1,2and HU Shengwu1,2

(1. State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas，Yangling Shaanxi 712100，China；2. College of Agronomy，Northwest A&F University，Yangling Shaanxi 712100，China )

This study was designed to analyze genetic diversity of EMS-induced mutant progenies inBrassicanapusL. using simple sequence repeat (SSR) and sequence-related amplified polymorphism (SRAP) molecular markers. The selected 138 M3mutant strains ofB.napuscv.‘Zhongshuang No.9’ which served as the control，with abundant morphological variation in leaf，flower and silique organs, was analyzed by 24 SRAP and 20 SSR primer pairs. A total of 360 amplified fragments including 102 polymorphic fragments were detected by 24 SRAP primer combinations，with an average 28.33% of polymorphic fragment percentage and 0.60 of polymorphism information content (PIC) value；whereas，196 amplified fragments containing 91 polymorphic fragments were detected by 20 SSR primer pairs，with an average 46.43% of polymorphic fragment percentage and 0.59 ofPICvalue. The genetic similarity coefficient between 139 experimental materials varied from 0.62 to 0.91. The cluster and population structure analysis exhibited that experimental materials are not exactly classified depending on phenotype mutation. In general，EMS-induced mutations in ‘Zhongshuang No.9’ can be detected at the molecular level and there are extensive genetic differences among the mutant progenies.

BrassicanapusL.；EMS-induced mutant；Genetic diversity；SSR marker；SRAP marker

2016-05-06 Returned 2016-07-06

Earmarked Found for China Agriculture Research System(No.CARS-13).

YUAN Runqin，female，master student. Research area：rapeseed genetics and breeding. E-mail：15091184922@163.com

HU Shengwu，male，Ph.D,professor，doctoral supervisor. Research area：rapeseed genetics and breeding.E-mail:swhu83251@nwsuaf.edu.cn

日期：2017-06-05

2016-05-06

2016-07-06

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-13)。 第一作者：袁潤勤，女，碩士研究生，從事油菜遺傳育種研究。E-mail:15091184922@163.com 通信作者：胡勝武，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事油菜遺傳育種研究。E-mail:swhu83251@nwsuaf.edu.cn

S565.4

A

1004-1389(2017)06-0855-10

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170605.1715.016.html