實驗小鼠燒傷后對皮膚解毒酶表達(dá)水平的影響

潘凌鴻，孫 杰，周士勝，倫永志,*

（1. 莆田學(xué)院 藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建 莆田 351100；2. 大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 遼寧省高校生物物理學(xué)重點實驗室，遼寧 大連116622）

實驗小鼠燒傷后對皮膚解毒酶表達(dá)水平的影響

潘凌鴻1，孫 杰1，周士勝2，倫永志1,*

（1. 莆田學(xué)院 藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建 莆田 351100；2. 大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 遼寧省高校生物物理學(xué)重點實驗室，遼寧 大連116622）

本文旨在通過檢測燒傷誘導(dǎo)的大鼠體內(nèi)煙酰胺降解的改變，探索皮膚本身可能在胰島素抵抗中起到的重要作用。此實驗通過檢測與解毒相關(guān)的酶的mRNA的表達(dá)（包括煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶、醛氧化酶、兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶、單胺氧化酶A、超氧化物歧化酶2、谷胱甘肽過氧化物酶1、過氧化氫酶和過氧化還原酶1）。進(jìn)而研究假燒傷大鼠與燒傷大鼠體內(nèi)的煙酰胺和N1-甲基煙酰胺的清除能力是否有所差異。結(jié)果表明，在燒傷大鼠的皮膚中酶均未表達(dá)，但假燒傷大鼠均有表達(dá)。假燒傷大鼠的煙酰胺的代謝能力大于燒傷大鼠的代謝能力且全層燒傷的大鼠皮膚中檢測不到異型生藥物代謝酶的表達(dá)。燒傷能降低機(jī)體對過多煙酰胺的清除能力。

燒傷；皮膚；煙酰胺

皮膚對異型生物質(zhì)及內(nèi)源性毒物的生物轉(zhuǎn)化、解毒和清除起著重要的作用。大面積燒傷后很快出現(xiàn)糖代謝紊亂和胰島素抵抗，數(shù)天內(nèi)達(dá)到高峰。通常認(rèn)為燒傷后胰島素抵抗與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。然而，即使燒傷愈合多年以后，胰島素抵抗還持續(xù)存在。我們推測，燒傷后胰島素抵抗可能與燒傷部位皮膚的生物轉(zhuǎn)化和排泄功能永久性喪失有關(guān)，因此通過檢測燒傷誘導(dǎo)的大鼠體內(nèi)煙酰胺降解的改變來探索該可能性。

代謝綜合征（metabolic syndrome），指一組多種代謝紊亂伴隨發(fā)生的集群，包括肥胖、胰島素抵抗、高血壓和血脂異常等，是2型糖尿病和心血管疾病的主要危險因素[1,2]。煙酰胺，B族維生素的一種，主要存在于動物肉類中，在世界上大多數(shù)國家已被作為食品添加劑強(qiáng)制性添加到面粉及谷物中。在過去二、三十年間，代謝綜合征出現(xiàn)了全球性快速流行趨勢，其發(fā)病與環(huán)境因素和生活方式有密切關(guān)系。越來越多的證據(jù)顯示，環(huán)境因素可能主要是那些增加體內(nèi)異型生物質(zhì)水平的因素，包括環(huán)境污染、藥物、高肉類飲食和食物添加劑等，而生活方式（例如久坐行為）的作用則在于削弱了機(jī)體的毒物代謝和排泄能力。在肉食攝入增加以及食用維生素和含添加劑食物增加的情況下，皮膚的解毒和排泄功能顯得尤為重要。

皮膚是人體最大的器官，在室溫下，只有少數(shù)小汗腺處于分泌活動狀態(tài)，無出汗的感覺（又稱不顯性出汗）。而與之相對應(yīng)的是顯性出汗，一般是溫度超過 30℃時，這時，排汗量就明顯增加，小汗腺也會相應(yīng)增加。汗液排泄一般在環(huán)境溫度較高時會發(fā)生，這樣的話，在環(huán)境溫度較低時，汗腺活動降低，這樣以來，需要通過皮膚的汗腺排泄的毒物就會受到一定阻礙。這樣的話，汗腺的活動減弱將直接導(dǎo)致體內(nèi)毒物的蓄積。值得注意到是，許多內(nèi)源性生物活性物質(zhì)也是皮膚藥物代謝酶的底物。其皮膚含有的藥物代謝酶和汗腺，在對內(nèi)外源性的毒物的解毒和清除方面起到了重要的作用。可能會引起皮膚功能永久地喪失的嚴(yán)重?zé)齻?，與長期胰島素抵抗相關(guān)聯(lián)。毒性物質(zhì)可以引發(fā)胰島素抵抗。這些證據(jù)都說明一種可能，即皮膚本身可能在胰島素抵抗中起到了重要的作用。所以皮膚在煙酰胺的代謝中就起到了重要的作用。所以皮膚在煙酰胺的代謝中就起到了重要的作用。這種排泄方式因不需進(jìn)行任何生物轉(zhuǎn)化，所以對于有藥物代謝酶功能缺陷的人來說，可能尤為重要[3]。我們通過檢測燒傷誘導(dǎo)的大鼠體內(nèi)煙酰胺降解的改變來探索該可能性。結(jié)果表明，在燒傷大鼠的皮膚中均未檢測到與解毒相關(guān)的酶的mRNA的表達(dá)（包括煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶，醛氧化酶，兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，單胺氧化酶A，超氧化物歧化酶2，谷胱甘肽過氧化物酶1，過氧化氫酶和過氧化還原酶 1），但假燒傷大鼠均有表達(dá)。與假燒傷大鼠相比，燒傷大鼠體內(nèi)的煙酰胺和N1-甲基煙酰胺的清除能力明顯降低。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

1.1.1 實驗動物

成年雄性Sprague-Dawley大鼠(SPF級)70只，體重180～200 g，購自大連醫(yī)科大學(xué)SPF級動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(遼)2008-0002。

1.1.2 主要試劑和實驗儀器

PrimeScript RT Master Mix購于寶生物工程（大連）有限公司；TRIZOL? Reagent（Invitrogen, Carlsbad,CA）；煙酰胺、葡萄糖、氯化鈉均購于Sigma公司（St.Louis, MO, USA）；煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品、TCEP、SBD-F、18-冠-6醚、4-bromophenacyl bromide、氫氧化鈉N1-甲基煙酰胺購于Takeda化學(xué)工業(yè)公司（Osaka，Japan）；Hypersil ODS C18 柱（Thermo，Bellefonte，PA, USA）；SupelcosilTM LC-SCX column（Supelco, Bellefonte,PA, USA）；熒光檢測器(Waters-470)（Milford, MA,USA）；L8-80MST-21超速離心機(jī)（貝克曼）；純水系統(tǒng)（MDF492/492AT）；Bio-Rad 550酶標(biāo)儀（Bio-Rad Co, California, USA）；UVP GDS-8000型 凝膠成像系統(tǒng)（UVP公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠燒傷模型的建立

成年雄性Sprague-Dawley大鼠（180～220 g）采用標(biāo)準(zhǔn)鼠糧喂養(yǎng)，自由飲水。按照文獻(xiàn)報道的方法[4]，對占大鼠總體表面積40%的背部皮膚予以全層燒傷。在帶蓋的密閉容器內(nèi)底部放入沾有乙醚的棉花，將大鼠放進(jìn)容器內(nèi)，蓋好蓋稍晃動容器，待大鼠昏迷不動后，將其抓出，背部浸入到95 °C的熱水中15 s。假燒傷大鼠操作同上，除了背部只是浸在25 °C溫水水中。

1.2.2 煙酰胺負(fù)荷試驗

（1）確定實驗對象分組，即：按照統(tǒng)計學(xué)方法，將成年雄性Sprague-Dawley大鼠（180～220 g）隨機(jī)分成假燒傷組和燒傷組。假燒傷組再隨機(jī)分成兩組：假燒傷對照組（組1，n=8）和假燒傷加煙酰胺組（組2，n=8）。燒傷組再隨機(jī)分成燒傷組（組 3，n=13）和燒傷加煙酰胺組（組 4，n=13）。同時在大鼠相關(guān)部位進(jìn)行標(biāo)號；

（2）在大鼠燒傷或假燒傷48 h后，禁食12 h，不禁水，然后組2和組4的大鼠給予煙酰胺腹腔注射；

（3）收集樣本血漿，直接液氮保存?zhèn)溆茫?/p>

（4）對樣本進(jìn)行檢測。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

（1）總RNA提取

①取肌肉（股直肌，肱二頭肌，背闊肌和腓腸?。┖捅巢科つw（燒傷和未燒傷的部位）樣本各 50～100 mg，放入含有1 mL Trizol Microtube管內(nèi)，用已經(jīng)高壓滅菌的剪刀將組織盡可能地剪碎，約30 min左右，室溫靜置 10 min；②于上述組織裂解液中加入氯仿200 μL，蓋緊Microtube管蓋，用手劇烈振蕩15 s。待溶液充分乳化（無分相現(xiàn)象）后，再室溫靜置5 min；③12000轉(zhuǎn)，4°C離心15 min；④取上清，移置另一Microtube管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒充分混勻后，室溫下靜置10 min；⑤12000轉(zhuǎn)，4°C離心10 min，棄去上清，吸取出殘留的異丙醇；⑥加入75%的乙醇l mL（勿觸及Microtube管底部沉淀），輕輕上下顛倒洗滌 Microtube管壁，12000轉(zhuǎn)，4°C離心5 min，棄去乙醇；⑦室溫干燥3 min，加入20～100 μL滅菌DEPC水溶解沉淀即得到提取出的RNA。

（2）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

①將提取出的RNA作為模板，與反轉(zhuǎn)錄的引物和dNTP Mixture混合，于PCR儀上進(jìn)行變性退火反應(yīng)，65 °C，5 min，4 °C；②按表1在上述Microtube管中配制轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液；③在PCR儀上按下列條件進(jìn)行反應(yīng)：

表1 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液配制

（3）PCR反應(yīng)：

①按表2配制PCR反應(yīng)液；相關(guān)引物序列見表3。②反應(yīng)條件

表2 PCR反應(yīng)液配制

表3 引物序列

（4）5 μL PCR產(chǎn)物上樣1.5%瓊脂糖凝膠電泳；

（5）紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析。

1.2.4 血漿中煙酰胺和N-甲基煙酰胺含量的測定

（1）煙酰胺測定

樣品預(yù)處理：取血漿200 μL于EP管中，加入100 μL 20% TCA震蕩混勻，12000轉(zhuǎn)，10 min離心，取出200 μL上清液于另一EP管中。分別加入25 μL 0.5 M HCl，100 mg NaCl，震蕩混勻，直到水相被NaCl充分飽和。用1 mL的水飽和乙酸乙酯抽提3次，棄去上層乙酸乙酯，然后用N2吹干殘余乙酸乙酯。加入 25 μL 0.5M NaH2PO4和 25 μL 0.4M KOH，震蕩混勻。隨后加入1 mL無水乙酸乙酯，震蕩混勻。3000轉(zhuǎn)，3 min離心，取出800 μL于另一EP管中，N2吹干。加入250 μL碘甲烷，混勻，避光保存24 h后用N2吹干。再加入200 μL雙蒸水，震蕩混勻后用水飽和的乙酸乙酯抽提3次，N2吹干殘留乙酸乙酯，此時血漿中的煙酰胺全部被轉(zhuǎn)換成N1-甲基煙酰胺。

加入內(nèi)標(biāo) 200 μL(50 ng/mL)，再加入 200 μL 100 mM苯乙酮，震蕩混勻，冰浴10 min。然后加入400μL 6M NaOH，震蕩混勻，冰浴 60 min。再加入 200 μL甲酸，震蕩混勻，冰浴60 min。最后置于沸水浴中3 min，生成熒光衍生物，冷卻后混勻準(zhǔn)備上機(jī)檢測。

流動相配置和樣品檢測：流動相：10 mM 庚烷磺酸鈉，50 mM 三乙胺水溶液(pH 3.20)：乙腈(78:22 v/v)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。樣品經(jīng)366 nm波長激發(fā)后于418 nm波長下用熒光檢測器檢測。

（2）N-甲基煙酰胺測定

樣品預(yù)處理：取血漿樣品200 μL，加入200 μL內(nèi)標(biāo)（N1-乙基煙酰胺，50 ng/mL），再加入20%TCA 100 μL，12000 g離心10 min去除血漿蛋白；加入100 mM苯乙酮200 μL，震蕩混勻10 s后冰浴10 min；再加入6 M濃NaOH400 μL，震蕩混勻10 s后冰浴60 min；最后加入甲酸200 μL，震蕩混勻10 s后冰浴15 min；沸水浴3 min后冷卻、經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，震蕩混勻進(jìn)樣分析。

流動相配置和樣品檢測：流動相由0.01 M庚烷磺酸鈉，0.5%三乙胺和 22%乙腈組成，用正磷酸調(diào)節(jié)PH為3.2；流速調(diào)節(jié)1.0 mL/min；20 μL樣品進(jìn)樣；樣品經(jīng)366 nm波長激發(fā)后于418 nm波長下用熒光檢測器檢測。

2 結(jié)果

2.1 燒傷后基因表達(dá)變化

我們首先研究了燒傷對異型生/藥物代謝酶（包括NNMT，AOX1，COMT和 MAO），ROS清除酶類（包括SOD，GPX1，CAT和PRDX1）和NADPH氧化酶復(fù)合體成分之一的p47-phox等基因表達(dá)的影響。如圖1所示，RT-PCR結(jié)果表明，這些所有的酶的mRNA在假燒傷大鼠的皮膚中均有表達(dá)，而在燒傷大鼠的皮膚中均未檢測到其表達(dá)。結(jié)果表明皮膚全層燒傷可能導(dǎo)致皮膚喪失解毒和抗氧化功能。

圖1 RT-PCR對大鼠皮膚中酶的mRNA表達(dá)的分析

2.2 燒傷對煙酰胺代謝的影響

眾所周知，煙酰胺可以引起氧化應(yīng)激，胰島素抵抗和糖耐量降低[5-7]。因此，對過多煙酰胺的清除能力可能是致胰島素抵抗的一個關(guān)鍵因素。已知皮膚中有降解煙酰胺酶的表達(dá)，即NNMT和AOX1，所以，我們研究燒傷對煙酰胺清除的影響。如圖2所示，組3的空腹血漿中的N1-甲基煙酰胺（煙酰胺的甲基化代謝物）水平明顯高于組1。煙酰胺負(fù)荷導(dǎo)致假燒傷組（組2）和燒傷組（組4）血漿中的煙酰胺和N1-甲基煙酰胺水平明顯增加。組4增加比組2更顯著。這些結(jié)果說明燒傷大鼠對煙酰胺和 N1-甲基煙酰胺的清除能力可能減弱了。大鼠皮膚對總煙酰胺的解毒能力的重要性和貢獻(xiàn)與煙酰胺降解酶類在其它器官/組織中的表達(dá)也有關(guān)聯(lián)。

圖2 燒傷引發(fā)的煙酰胺降解的改變

3 討論

代謝綜合征與環(huán)境溫度的變化有一定的關(guān)系，而作為受環(huán)境溫度影響較大的皮膚，自然，代謝綜合征則和皮膚的解毒，排毒功能自然會有一定的關(guān)系。皮膚在機(jī)體解毒方面有著重要的作用，皮膚的功能降低將直接影響機(jī)體的解毒功能。由于環(huán)境因素或者是個人的生活方式所引起的皮膚功能降低將直接導(dǎo)致皮膚的解毒功能下降。當(dāng)今快速流行的代謝綜合征，人體攝入的異型生物質(zhì)的增加也對其造成了嚴(yán)重威脅。這樣看來，適當(dāng)?shù)脑黾悠つw功能，如增加排汗，可以加強(qiáng)皮膚的解毒功能，對代謝綜合征的預(yù)防和治療有很大的作用。

汗液排泄一般在環(huán)境溫度較高時會發(fā)生，這樣的話，在環(huán)境溫度較低時，汗腺活動降低，這樣以來，需要通過皮膚的汗腺排泄的毒物就會受到一定阻礙。這樣的話，汗腺的活動減弱將直接導(dǎo)致體內(nèi)毒物的蓄積。一般活動并不能降低MetS的風(fēng)險，只有到達(dá)一定量的體力活動，才能降低MetS風(fēng)險[5]。

煙酰胺，B族維生素，主要存在于動物源性的食物中，尤其是肉類。煙酰胺是尼亞新的存在形式，主要用于營養(yǎng)補(bǔ)充劑和食物強(qiáng)化[8]。這就意味著西方飲食（尤其是以肉食為主）和尼亞新強(qiáng)化的食物可能會增加煙酰胺超載的風(fēng)險。我們的生態(tài)學(xué)證據(jù)表明，尼亞新的高消耗（主要源于尼亞新強(qiáng)化）與肥胖和 2型糖尿病等胰島素抵抗相關(guān)的疾病的流行呈明顯的相關(guān)性[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)燒傷大鼠降解煙酰胺的能力明顯降低，而過多的煙酰胺增加H2O2生成和加重?zé)齻蟮囊葝u素抵抗。這些觀察結(jié)果說明富含煙酰胺飲食的高消耗可能對燒傷病人有害。

值得注意的是，除了煙酰胺降解酶類，其他異型生物質(zhì)/藥物代謝酶，如細(xì)胞色素P450，黃素單氧化酶，MAO，COMT，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，N-乙?；D(zhuǎn)移酶和磺基轉(zhuǎn)移酶也在皮膚中表達(dá)[11-13]。不計其數(shù)的異型生物質(zhì)和內(nèi)源性的生物活性/毒性物質(zhì)都是這些酶類的底物。皮膚還表達(dá) SOD，CAT，GPX1和PRDX1，這些酶類均能清除 ROS，以此來抵抗氧化損傷[4,14]。而且，人的外分泌性汗腺，據(jù)估計，汗腺的總量與一個腎臟相當(dāng)（約100g），能夠排出眾多的異型生物質(zhì)（如金屬和藥物[15]），內(nèi)源性的生物活性物質(zhì)（如神經(jīng)遞質(zhì)，細(xì)胞因子，固醇類[4,15,16]），即使這些物質(zhì)很少以原形經(jīng)尿液排出（如煙酰胺[4]）。皮膚全層燒傷會導(dǎo)致燒傷區(qū)域皮膚功能的永久性喪失。本研究的結(jié)果，即燒傷后空腹血漿中N1-甲基煙酰胺的增高和煙酰胺負(fù)荷后糖耐量的降低，為該說法直接提供了有力的證據(jù)。

如前所述，胰島素抵抗是由氧化應(yīng)激引起的。氧化應(yīng)激能否發(fā)生取決于ROS產(chǎn)生和機(jī)體總的抗氧化能力二者之間的平衡，后者代表了各種器官抗氧化能力的總和。每個器官/組織對機(jī)體總的抗氧化系統(tǒng)的貢獻(xiàn)是不一樣的。例如，肝臟主要負(fù)責(zé)對異型生物質(zhì)和內(nèi)源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化/解毒，而腎臟主要負(fù)責(zé)對毒性物質(zhì)的排出。因此，這些器官任一功能的降低都可能增加氧化應(yīng)激和胰島素抵抗的危險。事實上，眾多的研究表明，嚴(yán)重肝臟[17]和腎臟疾病[18]的患者都與氧化應(yīng)激和胰島素抵抗相關(guān)聯(lián)。同肝臟和腎臟一樣，皮膚也是機(jī)體總的抗氧化防御系統(tǒng)的主要貢獻(xiàn)者之一，因為它是在解毒和排出內(nèi)外源性毒物中起重要作用的最大器官。能夠想象出，任何能降低皮膚功能的因素都能增加氧化應(yīng)激和胰島素抵抗的風(fēng)險。從這一觀點不難看出，燒傷導(dǎo)致的永久性皮膚丟失是一個降低皮膚功能的極端的例子。最新證據(jù)表明，皮膚功能降低和常見的代謝紊亂有明顯的關(guān)聯(lián)。例如，皮膚溫度，不同于總是保持在一個恒定水平的機(jī)體內(nèi)部器官溫度（核心溫度），它隨環(huán)境溫度的變化而波動。此外，寒冷環(huán)境導(dǎo)致皮膚血管收縮從而皮膚血流量減少[18]。因此，皮膚解毒和抗氧化功能可能受外界環(huán)境溫度的影響，因為皮膚細(xì)胞中酶參與的反應(yīng)和汗腺介導(dǎo)的毒性物質(zhì)的排出均依賴于溫度和血流量。一個有趣的現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)，冬天血中兒茶酚胺的水平高于夏季，另有研究發(fā)現(xiàn)，冬季尿排泄兒茶酚胺的終產(chǎn)物少于夏季[19]。這兩個研究結(jié)果提示，冬季時兒茶酚胺的降解/失活過程減弱?？紤]到皮膚中兒茶酚胺降解酶類（主要是MAO和COMT[20]）的活性碎室溫的變化而改變，兒茶酚胺降解的季節(jié)性變化很大程度上歸因于皮膚解毒功能的季節(jié)性變化。而且，非燒傷性的嚴(yán)重創(chuàng)傷，由于交感神經(jīng)過度興奮引起外周動脈血管收縮導(dǎo)致皮膚血流量減少，也會降低皮膚解毒和抗氧化功能。因此我們推測，非燒傷性創(chuàng)傷和胰島素抵抗二者之間有著密切的聯(lián)系[1]。這種說法能夠解釋為什么燒傷性創(chuàng)傷引起的胰島素抵抗（與皮膚永久性丟失有關(guān)）是永久的[21]，而非燒傷性創(chuàng)傷引起的胰島素抵抗（與皮膚功能暫時性降低有關(guān)）是可逆的[1]。

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Effects on Genes Expressiong Leve of Detoxification-related Enzymes Involved in the Burned Rat Skin

PAN Ling-hong1, SUN Jie1, ZHOU Shi-sheng2, LUN Yong-zhi1,*
(1. Department of Medical Laboratory, Putian University, Putian 351100, China; 2. Liaoning Provincial University Key Laboratory of Biophysics, College of Medicine, Dalian University, Dalian 116622, China)

To explore the skin it may play an important role in insulin resistance by examining the possibility that the burn-induced changes in nicotinamide degradation in rats. This assay was performed by detecting the detoxification-related enzymes mRNA tested in the rat skin (including nicotinamide N-methyltransferase, aldehyde oxidase, catechol-O-methyltransferase, monoamine oxidase A, superoxide dismutase 2, glutathione peroxidase 1,catalase, and peroxiredoxin 1). And to research the difference between the false burned rats and the burned rats about the clearance of nicotinamide and N1-methylnicotinamide. The results showed that none of the detoxification-related enzymes was detected in burned rat skin. Furthermore, the burned rats cannot detect the enzyme expression of drug metabolizing. The clearance of nicotinamide and N1-methylnicotinamide in burned rats was significantly decreased.

burn injury; skin; nicotinamide

R751

A

1008-2395(2017)03-0069-06

2017-01-05

國家自然科學(xué)基金項目（31140036）。

潘凌鴻（1986-），女，助理實驗師，研究方向：分子生物學(xué)。

倫永志（1973-），男，博士，教授，研究方向：感染性疾病的分子生物學(xué)。