白腐真菌的分離及其固定化應用研究

張莉，汪志

武漢工程大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 武漢 430205

白腐真菌的分離及其固定化應用研究

張莉，汪志

武漢工程大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 武漢 430205

通過愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基和鞣酸培養(yǎng)基對白腐真菌所產漆酶的顯色作用分離篩選出白腐真菌；采用“吸附-包埋-交聯(lián)”的復合固定化方法，以改性稻殼作為吸附載體，聚乙烯醇、海藻酸鈉為包埋劑，硼酸、CaCl2為交聯(lián)劑，制備了白腐真菌固定化生物小球；將該生物小球應用于廢水處理，分別研究了生物小球投加量、曝氣量、處理時間、處理溫度、pH值等因素對廢水處理效果的影響.結果表明，在小球投加量為20%，曝氣量為2 L/min，處理時間為8 h，處理溫度為35℃，pH范圍為4.5～5的實驗條件下，處理后的廢水化學需氧量（COD）值可由1 027 mg/L降至94.5 mg/L，COD去除率可達90.8%.

白腐真菌；分離；固定化

白腐真菌是一類能引起木質白色腐爛作用的絲狀真菌的總稱［1］，其生物種類的多樣性以及其特殊的降解機制［2］，備受國內外學者關注.白腐真菌生物降解的廣譜性，體現(xiàn)在其對生物難降解物質如農藥、苯類化合物、鹵化物等的降解［3-5］，因此在工業(yè)廢水處理中多有應用.

在實際工業(yè)應用中，離散型的白腐真菌在廢水處理過程中，常出現(xiàn)絲狀菌大量增殖引起的膨脹現(xiàn)象，導致運行不穩(wěn)定.生物固定化技術作為現(xiàn)代生物過程領域的新型技術［6］，可有效解決此類問題.微生物固定技術的機理主要有吸附、包埋、共價、結合作用［7］，其中包埋法不僅操作簡單，制作的固定化生物小球強度高，而且可防止生物外流［8］，因此實際應用較為廣泛.鄭宇［9］、茆云漢［10］等人研究了“包埋-交聯(lián)”的復合固定技術對微生物進行固定化處理，均取得了良好的處理效果.

本實驗將分離篩選出的白腐真菌進行固定化處理，改進傳統(tǒng)包埋固定的方法，采用“吸附-包埋-交聯(lián)”制備出固定化微生物球，并將其應用于廢水處理.實驗所用廢水為“萃取-生物”一體化裝置［11］萃取處理后的含氯化工廢水，廢水中所含氯有機物經一體化裝置的萃取處理，其質量濃度已降至白腐真菌耐受限度，對馴化過的白腐真菌已無毒害作用；測得廢水的COD值約1 027 mg/L.

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 實驗儀器與試劑

實驗儀器：超凈工作臺、不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器、生化培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、數(shù)顯恒溫水浴鍋、電子天平、精密pH計、微波爐等.

實驗試劑：愈創(chuàng)木酚；鞣酸；聚乙烯醇（1799型，醇解度98.0%～99.0%）；海藻酸鈉（化學純）；重鉻酸鉀（優(yōu)級純）；硫酸亞鐵銨（分析純）；其余試劑均為分析純.

實驗材料：活性炭粉，購自國藥集團化學試劑有限公司，研磨后過孔徑為125 μm的篩；稻殼粉，購自仙桃市某糧食加工廠，研磨后過125 μm篩；改性稻殼粉，用2 mol/L硫酸浸漬8 h，過濾水洗后烘干.

1.1.2 培養(yǎng)基

1）PDA培養(yǎng)基［12］：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，H2O 1 L，pH值6.0～7.0；

2）PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基：含有質量分數(shù)為0.1%愈創(chuàng)木酚的PDA培養(yǎng)基；

3）PDA-鞣酸培養(yǎng)基：含有質量分數(shù)為0.1%鞣酸的PDA培養(yǎng)基.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離、篩選

1）菌種的分離

實驗選取的土壤、腐枝樣品來自于武漢工程大學某落葉林，采用平板劃線法接種在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4 d～5 d后挑取白色絮狀菌絲轉接到新鮮相同的培養(yǎng)基上，反復轉接直至得到純的菌株.

2）菌種的篩選

愈創(chuàng)木酚和鞣酸對白腐真菌所產生的漆酶具有明顯的顯色作用，經過反復篩選可篩選出所需的白腐真菌［13］.從PDA培養(yǎng)基中挑選長勢優(yōu)良的菌株，挑取其菌絲接種到PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d～6 d后，挑出顯磚紅色的菌株，在PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上反復接種，直至出現(xiàn)穩(wěn)定的變色現(xiàn)象.將篩出的菌株接種在PDA-鞣酸培養(yǎng)基上，挑出顯紫色的菌株，在PDA-鞣酸培養(yǎng)基上反復轉接，直至出現(xiàn)穩(wěn)定的變色現(xiàn)象.

3）顯微鑒別

本實驗采用簡單染色法對分離篩選出的菌株制片觀察.取潔凈載玻片一塊，在其中央加一滴無菌水，用灼燒并冷卻后的接種環(huán)挑取少量菌絲浸潤在其中.用美藍染液對其染色，蓋上蓋玻片，水洗去除多余染液，用吸水紙吸去載玻片上的水珠，自然干燥后鏡檢.

1.2.2 白腐真菌的固定化

1）固定化方法

將分離篩選出的白腐真菌在培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)，離心分離出菌體備用，采用“吸附-包埋-交聯(lián)”的復合固定化法對其進行固定化.

實驗中以聚乙烯醇、海藻酸鈉為固定化載體，硼酸和氯化鈣為交聯(lián)劑，分別摻加活性炭粉、稻殼、改性稻殼作為吸附載體，制備出活性炭、稻殼和改性稻殼的固定化生物小球.

2）凝膠小球的制備

按照“質量分數(shù)為10%聚乙烯醇+質量分數(shù)為1.0%海藻酸鈉+質量分數(shù)為1.0%外源摻加物”的比例制備固定化生物小球，其中外源摻加的吸附載體為活性炭粉、稻殼等.

向60 mL蒸餾水中加入聚乙烯醇6.0 g、海藻酸鈉0.6 g，加熱至95℃以上使其溶解，添加活性炭粉0.6 g，混勻；冷卻后再投加離心分離的菌體6.0 g，混勻后備用.用滴管吸取上述膠狀液體，逐滴滴入到質量分數(shù)為2%CaCl2、質量分數(shù)為3%硼酸交聯(lián)溶液中，交聯(lián)固化24 h；24 h后用生理鹽水洗凈，用COD值約400 mg/L的溶液進行活化.制備出活性炭固定化生物小球.

稻殼、改性稻殼固定化生物小球制備方法同上.

3）外源摻加吸附載體的篩選

按照上述方法制備空白固定化生物小球（僅不摻加吸附載體，其他均相同），并分別將制備的空白、活性炭、稻殼和改性稻殼四種固定化生物小球進行COD降解實驗，以確定摻加的最佳吸附載體類型.

1.2.3 固定化凝膠小球應用研究確定最佳吸附載體類型后，制備該類型凝膠小球若干，將其應用于廢水處理；分別研究小球投加量、時間、曝氣量、溫度及pH對廢水處理效果的影響，以確定該固定化生物小球處理廢水的最佳環(huán)境條件.

1.3 分析方法

為了檢驗實驗效果，采用COD的去除率來表征.

COD的測定：采用快速消解滴定法［14］.

2 結果與討論

2.1 菌種的分離、篩選

2.1.1 菌種的分離經平板劃線接種培養(yǎng)4 d后，每個培養(yǎng)皿約有5～7個菌落，各菌落能較清晰地分離.經過多次轉接，菌落不斷純化，通過顯微鏡觀察，菌落中再無雜菌，所分離的菌落可認為是純的菌落.其中的兩種菌種，外觀形態(tài)如圖1所示.

圖1 菌種的分離Fig.1Separation of strains

由圖1可以看出，接種到PDA培養(yǎng)基上的菌種，能快速生長，長出的菌絲能較快向四周伸展，從而能快速長出較大的菌落.

2.1.2 菌種的篩選將分離出的純菌種分別接種到PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，挑出有磚紅色變色現(xiàn)象的菌種繼續(xù)接種，經過3次轉接，出現(xiàn)了穩(wěn)定的磚紅色變色現(xiàn)象，如圖2（a）所示；將PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基篩選出的菌種接種到PDA-鞣酸培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選，挑出有紫色變色現(xiàn)象的菌種繼續(xù)轉接，經過2次轉接，出現(xiàn)了穩(wěn)定的紫色變色現(xiàn)象，如圖2（b）所示.

圖2 （a）愈創(chuàng)木酚和（b）鞣酸復篩Fig.2Repeated screening by（a）guaiacol medium and（b）tannic acid medium

根據以上的特定顯色反應，可以認為所篩選出的菌種為白腐真菌，引起變色反應的是其分泌的降解酶系的漆酶.

2.1.3 顯微鑒別為進一步研究分離出的白腐真菌，對其顯微觀察以做進一步的鑒別.用接種環(huán)挑取少量菌絲，置于滴有水滴的載玻片上，輕輕剝離菌絲，使其松散分散；滴加美蘭染液進行染色，蓋上蓋玻片，水洗去除多余染液，吸干水后放在顯微鏡下觀察即可.如圖3所示.

圖3 白腐真菌顯微放大圖像Fig.3Microscopic images of white-rot fungi

圖3為生物顯微鏡下拍攝，菌絲均用質量分數(shù)為1%的美藍染色.圖3（a）為放大400倍，圖3（b）為放大1 000倍.菌絲結狀分隔，纖維菌絲較多，菌絲大量分枝，無鎖狀聯(lián)合.

2.2 白腐真菌的固定化

2.2.1 凝膠小球的制備實驗中的固定化生物小球采用“吸附-包埋-交聯(lián)”的復合固定化法，按“質量分數(shù)為10%聚乙烯醇+質量分數(shù)為1.0%海藻酸鈉+質量分數(shù)為1.0%吸附載體”的質量比制備而成.制備出的小球呈白色、較規(guī)則的球形，顆粒飽滿，大小均勻，粒徑3 mm～4 mm，如圖4（a）所示；制備的凝膠小球經交聯(lián)24 h后，對其進行活化處理，活化后白色褪去，略顯黃色，如圖4（b）所示.

圖4 固定化微生物小球外觀效果圖（a）活化前，（b）活化后Fig.4Appearance shape of immobilized microbial pellets（a）before the activation and（b）after the activation

2.2.2 摻加外源吸附載體的篩選將制備的空白、活性炭、稻殼和改性稻殼4種凝膠小球進行COD降解實驗，以確定最佳外源摻加吸附載體類型.配置試驗培養(yǎng)液，測得其COD值為986.3 mg/L；試驗采用250 mL錐形瓶，加入200 mL培養(yǎng)液，按其體積分數(shù)20%的投加量加入凝膠小球，置于25℃恒溫水浴鍋中靜置培養(yǎng)；8 h后測定各培養(yǎng)液剩余COD濃度.COD去除率的關系如圖5所示.

圖5 不同類型的固定化小球對COD去除率的影響Fig.5Effects of different types of immobilized pellets on removal rate of COD

由圖5可以看出，與空白小球相比，摻加活性炭、稻殼和改性稻殼的小球對降解COD效果均有提高，以改性稻殼效果最為明顯.這是因為在固定化過程中摻加吸附載體，對提高小球的結構穩(wěn)定性、通透性以及生物穩(wěn)定性具有明顯效果.與活性炭、普通稻殼相比，在相同摻入量下，摻入改性稻殼有更好的效果.故本實驗選擇摻加的吸附載體為改性稻殼.

2.3 白腐真菌的固定化應用

選擇改性稻殼為吸附載體后，制備出固定化生物小球，將其應用于廢水處理，以確定其處理廢水的最佳環(huán)境條件.

2.3.1 投加量對處理效果的影響設置固定化生物小球的投加量（按培養(yǎng)液的體積比）分別為2%、5%、8%、12%、15%、20%、25%、30%，在恒溫25℃下靜置培養(yǎng)8 h，測定廢水COD降解情況，以判斷不同投加量下的廢水處理效果.實驗結果投加量對處理效果的影響如圖6所示.

由圖6可知，投加量在2%～15%范圍內時，COD去除率隨投加量的增大顯著提高；繼續(xù)增大投加量，COD去除率僅小幅提升，繼而基本保持平穩(wěn).當投加量增大到20%以后，COD去除率再難提高.基于經濟成本及工業(yè)化應用等方面的考慮，繼續(xù)增大固定化小球的投加量必將增加處理成本，故可確定最佳投加量為20%.

圖6 投加量對處理效果的影響Fig.6Effects of dosage on treatment

2.3.2 時間對處理效果的影響設置生物小球投加量為20%，在恒溫水浴25℃條件下靜置培養(yǎng)，在培養(yǎng)0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h等時間后測定COD的去除效果，以判斷不同時間下對廢水處理效果的影響.實驗結果見圖7.

圖7 時間對處理效果的影響Fig.7Effects of time on treatment

由圖7可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，COD去除率逐漸提高，培養(yǎng)時間8 h為拐點，繼續(xù)延長培養(yǎng)時間對COD的去除無明顯影響，說明在8 h時微生物對COD再難降解.故最佳處理時間為8 h.

2.3.3 曝氣量對處理效果的影響設置生物小球投加量為20%，培養(yǎng)溫度為25℃，采用微型可調曝氣機對其進行曝氣培養(yǎng)，設置曝氣量分別為0 L/min、1 L/min、2 L/min、4 L/min、6 L/min、8 L/min，8 h后測定COD的去除效果，以判斷不同曝氣量對廢水處理效果的影響.實驗結果如圖8所示.

圖8 曝氣量對處理效果的影響Fig.8Effects of aeration rate on treatment

由圖8可以看出，隨著曝氣量的增大，COD去除率逐漸提高，曝氣量2 L/min為拐點，繼續(xù)增大曝氣量對COD的去除無明顯影響，說明曝氣量足夠大時，曝氣量不再對COD的去除造成影響.故最佳曝氣量為2 L/min.

2.3.4 溫度對處理效果的影響設置生物小球投加量為20%，曝氣量為2 L/min，在設定的不同溫度條件下進行曝氣培養(yǎng)，8 h后測定COD的去除效果，以判斷不同溫度對廢水處理效果的影響.實驗結果如圖9所示.

圖9 溫度對處理效果的影響Fig.9Effects of temperature on treatment

由圖9可以看出，在10℃～35℃的溫度范圍內，廢水的COD去除率隨溫度升高而增大；隨著溫度繼續(xù)升高，COD去除率開始下降.故本實驗固定化微生物小球處理廢水最佳溫度為35℃.

2.3.5 pH對處理效果的影響設置生物小球投加量為20%，曝氣量為2 L/min，在設定的不同pH條件下進行曝氣培養(yǎng)，8 h后測定COD的去除效果，以判斷不同pH對廢水處理效果的影響.實驗結果如圖10所示.

圖10 pH對處理效果的影響Fig.10Effects of pH on treatment

由圖10可知，pH值為4.5～5之間出現(xiàn)COD去除率的峰值，當pH低于4.5或高于5時，COD去除率明顯降低.故本實驗固定化生物小球處理廢水最佳pH范圍為4.5～5.

綜上所述，制備的改性稻殼固定化微生物小球處理廢水的最佳環(huán)境條件為：固定化微生物小球投加量為20%，處理時間為8 h，曝氣量為2 L/min，處理溫度為35℃，廢水處理pH范圍為4.5～5；最佳環(huán)境條件下廢水的COD去除率可達90.8%，處理后的廢水COD值由1027 mg/L降至94.5 mg/L，達到《污水綜合排放標準》（GB 8978-1996）中一級排放標準［15］.

3 結語

將分離篩選出的白腐真菌進行固定化處理，制備出固定化生物小球，并將其應用于廢水處理，得出實驗結論如下：

1）分離篩選出的菌株能與愈創(chuàng)木酚、鞣酸發(fā)生特征顯色反應，其分泌的胞外酶屬于白腐真菌的特征酶系，因此分離出的菌株是一種白腐真菌.

2）摻加吸附載體有利于白腐真菌的固定化，以改性稻殼作為外源吸附載體優(yōu)于活性炭及普通稻殼.

3）在投加量為20%，曝氣量為2 L/min，溫度為35℃，pH范圍為4.5～5，處理時間為8 h的條件下，固定化生物小球處理廢水效果最佳，COD去除率可達90.8%.

后期實驗工作將白腐真菌的固定化生物小球應用于“萃取-生物”一體化裝置的生物部分，進一步研究其對含氯化工廢水的處理，使其更加穩(wěn)定化、系統(tǒng)化.

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本文編輯：張瑞

Separation,Immobilization and Application of White-Rot Fungi

ZHANG Li，WANG Zhi
School of Chemistry and Environmental Engineering，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430205，China

A kind of white-rot fungus was separated by the color reaction of its laccase on guaiacol medium and tannic acid medium.Then the white-rot fungus was made into immobilized biological pellets by adsorption，embedding and crosslinking，using modified rice husk as adsorption carrier，polyvinyl alcohols and sodium alginate as embedding medium，and boric acid and CaCl2as crosslinking medium.The effects of biological pellets'dosage，aeration rate，reaction temperature，reaction time and pH value on the treatment effect were investigated.Results indicate that the removal rate of chemical oxygen demand（COD）can reach 90.8%and the residual COD concentration reduces from 1 027 mg/L to 94.5 mg/L at the biological pellets'dosage of 20%，aeration rate of 2 L/min，reaction time of 8 h，reaction temperature of 35℃and pH values of 4.5-5.

white-rot fungi；separation；immobilization

X703.1

A

10.3969/j.issn.1674?2869.2017.03.001

1674-2869（2017）03-0205-06

2016-12-09

張莉，碩士，教授.E-mail：dygzhangli@163.com

張莉，汪志.白腐真菌的分離及其固定化應用研究［J］.武漢工程大學學報，2017，39（3）：205-210. ZHANG L，WANG Z.Separation and immobilization of white-rot fungi［J］.Journal of Wuhan Institute of Technology，2017，39（3）：205-210.