分子標記輔助選育攜帶抗稻瘟病基因Pi65（t）的水稻新品種

趙家銘，王麗麗，馬作斌，王昌華，鄭文靜

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新中心，遼寧沈陽 110161）

分子標記輔助選育攜帶抗稻瘟病基因Pi65（t）的水稻新品種

趙家銘，王麗麗，馬作斌，王昌華，鄭文靜

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新中心，遼寧沈陽 110161）

港育129攜帶主效抗稻瘟病基因Pi65（t），以港育129為父本，遼星1號為母本，F(xiàn)1代與遼星1號回交，用連鎖標記InDel-1對BC1F2代進行篩選，從中選取農(nóng)藝性狀與遼星1號相似且攜帶純合Pi65（t）的單株進行花藥培養(yǎng)，獲取優(yōu)質(zhì)抗病新品系遼粳168，2014年參加遼寧省水稻區(qū)域試驗晚熟組，2017年通過遼寧省農(nóng)作物品種審定委員會審定。

稻瘟病分子育種抗病基因

由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是一種世界性的稻作病害，在世界各水稻產(chǎn)區(qū)每年都有不同程度的發(fā)生（Zeigler RS et al．，1994）［1］。該病發(fā)生時產(chǎn)量一般減少10%～20%，較嚴重的地區(qū)可達40%～50%，局部區(qū)域甚至顆粒無收（Kush GS et al．，2009；Liu J L et al．，2010）［2～3］。我國北方粳稻年栽培面積達466．7萬hm2以上，占全國粳稻生產(chǎn)面積近60%。近20年來，盡管在高產(chǎn)育種上有巨大突破，但由于稻瘟病菌復雜多變，且品種抗譜狹窄，加之品種單一化大面積種植，導致很多育成的超級稻品種推廣幾年即喪失了抗性。改良這些主栽水稻品種的抗性，同時不改變其原有的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等優(yōu)良農(nóng)藝性狀，是廣大育種者一直追求的目標。隨著分子標記技術的普及，利用雜交、回交，采用分子標記輔助導入及聚合主效抗稻瘟病基因已成為目前抗病育種的主要方向（Fukuoka S et al．，2009）［4］。

多年來，抗稻瘟病分子標記輔助育種也取得了巨大的成就，攜帶不同抗病基因的水稻品種已在生產(chǎn)中不同程度得到應用（王忠華等，2004；陳學偉等，2004；胡景濤等，2010；郭振華等，2013；梁毅等，2013；田紅剛等，2016；王飛等，2016）［5～12］。港育129是由遼寧省東港市農(nóng)業(yè)技術推廣中心育成并于2009年經(jīng)遼寧省品種審定委員會審定的水稻品種，經(jīng)人工接種，該品種對遼寧地區(qū)流行的多個生理小種均表現(xiàn)抗病。項目組前期利用SLAF-BSA技術從港育129中定位到一個抗稻瘟病基因Pi65（t），并篩選到一個與該基因緊密連鎖的分子標記InDel-1（Zheng et al．，2016）［13］，本研究以港育129和遼星1號為親本，通過雜交、回交及后代的分子標記輔助選擇及花藥培養(yǎng)育成了一個水稻新品種，其農(nóng)藝性狀與遼星1號較為相似，且攜帶主效抗稻瘟病基因Pi65（t）。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

抗病供體親本港育129，感病受體親本遼星1號，均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 雜交與回交

2010年初在海南以港育129號為父本，以遼星1號為母本雜交獲得F1。2010年夏在沈陽以遼星1號為母本，以F1為父本回交，獲BC1F1，2010年冬BC1F1在海南自交，獲BC1F2。

1.2.2 雜交后代的分子標記輔助選擇

從BC1F2中選擇株型與遼星1號相似的單株，采用改良的CTAB法提取葉片DNA，利用In-Del-1F：5’-ATCTTACCTC AACATTGCC-3’和In-Del-1R：5’-AGACATGTTG AAGACGCCT-3’進行基因擴增，PCR反應體系如下：2×Taq PCR Master Mix（艾德萊PC0902）10 μl，10 μm的引物各0．5 μl，100 μg／ml的模板DNA 1 μl，ddH2O 8 μl［14］。PCR反應程序為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸70 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。取4 μl PCR產(chǎn)物，利用6%聚丙烯酰氨凝膠電泳鑒定各個體基因型，篩選只獲得一條長約140 bpPCR產(chǎn)物的個體，從田間取其單核靠邊期花藥，按照鄭文靜等的方法進行花藥培養(yǎng)［15］。

20世紀80年代，根策爾拜入激光發(fā)明者之一、諾貝爾獎得主、物理學家查爾斯·湯斯（Charles Townes）的門下，進入加州大學伯克利分校作博士后研究。他曾在最近的一次電話訪談中表示：“湯斯對我很好，我覺得自己就像是他的小兒子一樣。”正是從那時起，根策爾對銀河系中心的這個黑暗天體產(chǎn)生了興趣。

1.2.3 純合品系的產(chǎn)量比較試驗

將通過花藥培養(yǎng)獲得的純合品系連同對照品種遼星1號種植于田間，小區(qū)面積4．8 m2，隨機區(qū)組設計，3次重復，秋季收獲，測產(chǎn)。

1.2.4 品種區(qū)域試驗

2012年至2013年在沈陽、東港和莊河分別進行了品種比較試驗及小面積示范，選出產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)及高抗稻瘟病的材料創(chuàng)新1號（品比編號DH170）。2014年參加遼寧省水稻區(qū)域試驗晚熟組預備試驗，2015～2016年參加遼寧省水稻區(qū)域試驗晚熟組，更名為遼粳168。2016年同時參加遼寧省水稻生產(chǎn)試驗晚熟組。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用Pi65（t）連鎖標記InDel-1檢測BC1F2代個體

在抗病鑒定圃中種植港育129／遼星1號BC1F2群體（單株插秧），根據(jù)株型及生育期等從BC1F2中選擇農(nóng)藝性狀與遼星1號相似的單株，取葉片提取DNA，利用InDel-1進行PCR擴增，同時記錄各單株的稻瘟病抗病結(jié)果，由圖1可見，BC1F2群體中各個體在Pi65（t）位點呈現(xiàn)分離，其中與港育129基因型一致的即只擴增出1條長度約140 bp片段的個體均對稻瘟病表現(xiàn)抗病。

2.2 品種比較試驗結(jié)果

取所篩選的篩選25個攜帶純合Pi65（t）的單株單核靠邊期花藥，通過花藥培養(yǎng)獲取再生植株800余株，冬季移栽于海南后收獲205個純合株系。從中選取了農(nóng)藝性狀與遼星1號接近的12個品系DH1、DH23、DH31、DH32、DH36、DH86、DH109、DH110、DH130、DH170、DH180和DH201，以遼星1號為對照進行產(chǎn)量比較試驗，方差分析結(jié)果表明，參試水稻品系間產(chǎn)量差異達顯著水平（表1）；其中DH170平均產(chǎn)量771．37 kg／667m2，較對照遼星1號增產(chǎn)顯著，在14個品系中排名第1；而DH1、DH23、DH32、DH36、DH86、DH109、DH110、DH130、DH180和DH201產(chǎn)量與遼星1間差別不顯著；DH31平均產(chǎn)量為587．12 kg／667m2，顯著低于其它品系（表2）。

2.3.1 參試過程及產(chǎn)量表現(xiàn)

2014年將排名第1的品系DH170命名為“創(chuàng)新1號”，參加了遼寧省水稻區(qū)域試驗預備試驗（晚熟組）。試驗結(jié)果表明該品系在丹東、莊河和普蘭店對稻瘟病均表現(xiàn)高抗，且平均產(chǎn)量683．5 kg／667m2，比對照金禾1號增產(chǎn)8．3%，在32個參試品種中排名第1位。

2015～2016年創(chuàng)新1號更名為遼粳168，參加遼寧省水稻區(qū)域試驗（晚熟組），14點次均增產(chǎn)，兩年平均產(chǎn)量613．4 kg／667m2，比對照金禾1號增產(chǎn)11．7%；2016年參加同組生產(chǎn)試驗，平均產(chǎn)量555．2 kg／667m2，比對照金禾1號增產(chǎn)8．8%。

2.3.2 農(nóng)藝性狀

生育期162 d左右，屬晚熟品種。苗期葉色濃綠，葉片上沖，株高110．0 cm，株型緊湊，分蘗力較強，主莖16片葉，半散穗型，穗長17．4 cm，穗粒數(shù)119．9粒，千粒重26．8 g，穎殼黃褐色，有芒。

2.3.3 米質(zhì)檢測結(jié)果

經(jīng)農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（杭州）測定，糙米率82．3%，精米率72．9%，整精米率71．4%，粒長5．2 mm，籽粒長寬比2．0，堊白粒率3%，堊白度0．2%，透明度2級，堿硝值7．0，膠稠度69 mm，直鏈淀粉17．6%，蛋白質(zhì)7．7%，米質(zhì)優(yōu)。

2.3.4 抗病檢測結(jié)果

經(jīng)2015～2016兩年田間穗頸瘟病情鑒定調(diào)查，抗穗頸瘟。

圖1 分子標記Indel-1在港育129／遼星1號BC1F2群體中基因型

表1 各品系產(chǎn)量方差分析

表2 參試各品系產(chǎn)量比較 （kg／667m2）

3 討論

傳統(tǒng)的水稻抗病育種依賴于表型鑒定和抗性鑒定的結(jié)果進行選擇，要求育種者具有豐富的經(jīng)驗，需要多年的育種周期，并且還受病原菌、溫濕度、光照等氣候因素影響，選擇的結(jié)果容易造成誤差，甚至造成抗性基因的丟失，選擇效率往往較低［16］。分子標記輔助選擇育種是基于標記基因型進行分析和選擇，其篩選結(jié)果不受環(huán)境因素影響，故能極大提高抗病植株選擇的準確性和育種效率［17］。楊豐宇等在研究中利用共顯性標記對稻瘟病抗性表型的選擇效率可達到100%［16］。孫永建等利用分子標記輔助選擇的方法改良了水稻恢復系R997對稻瘟病的抗性，認為這種育種方法既能縮短基因定位研究與育種應用的距離，又可以減少費用和育種年限，提高篩選效率［18］。

本研究利用抗稻瘟病基因Pi65（t）的連鎖標記InDel-1輔助選擇，成功從港育129／遼星1號BC1F2群體中篩選出12個攜帶純合Pi65（t）且農(nóng)藝性狀與感病親本遼星1號相似的品系，經(jīng)鑒定，這些材料均對稻瘟病表現(xiàn)抗病，表明利用InDel-1進行抗病基因Pi65（t）的前景選擇效率及準確性均較高。由于本研究選用的抗病育種親本港育129與遼星1號農(nóng)藝性狀相似，兩品種間僅存在生育期、產(chǎn)量及抗性方面的差異，故在雜交后代的背景選擇方面僅根據(jù)田間調(diào)查數(shù)據(jù)進行判斷即可獲取理想的結(jié)果。但在抗病分子改良的過程中，如果父母本間差異較大、后代分離較為顯著時，除利用抗病基因的連鎖標記進行前景選擇外，尚需利用芯片或不用品種間的多態(tài)性SSR標記來鑒定不同材料的遺傳背景，從而可獲得抗性提高且農(nóng)藝性狀與需改良感病親本相似的個體，最大限度保持原有品種的優(yōu)異性狀。

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S511．03

B

1002－1728（2017）03－0028－04

10．3969／j．issn．1002－1728．2017．03．006

2017－06－08

國家自然科學基金項目（31571993）；國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD0100500）

趙家銘（1981－），男，遼寧海城人，碩士，副研究員，從事水稻抗病分子改良工作。E-mail：zhaojiaming2011＠126．com

鄭文靜（1974－），女，吉林公主嶺人，博士，研究員。E-mail：zwj27＠126．com