株洲地區(qū)北京基因型結(jié)核分枝桿菌感染與利福平耐藥的相關(guān)研究

譚英征 陳雙華 肖鵬程 李丹 傅京力 龍?jiān)畦T

株洲地區(qū)北京基因型結(jié)核分枝桿菌感染與利福平耐藥的相關(guān)研究

譚英征1陳雙華2肖鵬程1李丹1傅京力1龍?jiān)畦T1

目的 研究北京基因型結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染的易感因素及其與利福平耐藥的相關(guān)性。 方法 收集株洲市2014年5月至2016年8月痰抗酸染色陽(yáng)性肺結(jié)核患者156例痰標(biāo)本，對(duì)MTB進(jìn)行分離培養(yǎng)與菌種鑒定。培養(yǎng)陽(yáng)性菌株行DNA提取，運(yùn)用RD105缺失基因檢測(cè)法鑒定北京基因型MTB、Xpert MTB/RIF檢測(cè)法鑒定耐利福平MTB，分析性別、年齡、糖尿病、復(fù)治患者以及利福平耐藥與北京基因型的關(guān)系。結(jié)果 156例痰標(biāo)本中培養(yǎng)出分枝桿菌150株，其中MTB菌株142株，非MTB菌株8株。女性患者的北京基因型MTB(38/68，55.8%)的比例明顯高于男性患者 (13/74，17.5%)，復(fù)治患者北京基因型MTB(26/55，47.2%)比例明顯高于初治患者(18/87，20.6%)，糖尿病患者北京基因型MTB(32/61，52.4%)比例明顯高于非糖尿病患者北京基因型MTB(19/81，23.4%)，年齡≥55歲的患者北京基因型MTB(31/60，51.6%)明顯高于年齡≤30歲的患者 (4/30，13.3%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在耐利福平菌株中北京基因型MTB(40/48，83.3%)明顯高于非耐利福平菌株中北京基因型MTB(11/94，11.7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 女性、高齡、并發(fā)糖尿病、復(fù)治，可能是感染北京基因型MTB的危險(xiǎn)因素。北京基因型MTB與利福平耐藥有明顯相關(guān)性。

分枝桿菌，結(jié)核；RD105；利福平耐藥；Xpert MTB/RIF

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題，是我國(guó)重點(diǎn)控制的重大疾病之一。中國(guó)是全球結(jié)核病第二大高負(fù)擔(dān)國(guó)家[1]，年新發(fā)結(jié)核病患者例數(shù)約130萬(wàn)[2]，患病人數(shù)僅次于印度，居全球第二，給社會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。全世界有三分之一的結(jié)核病由北京基因型MTB引起。北京基因型菌株是一類具有相似遺傳背景的結(jié)核分枝桿菌，根據(jù)不同的基因特征，可將北京基因型家族成員進(jìn)一步分為許多亞型，依次區(qū)分不同的北京家族株成員。這類菌株分布廣泛，在世界各地都發(fā)現(xiàn)有北京基因型菌株的流行，其致病性強(qiáng)、傳播迅速以及耐藥形成更容易[3-4]，多次造成爆發(fā)流行。但在世界不同地區(qū)北京基因型菌株的比列差距大，在中東、西歐、拉丁美洲等地區(qū)較低，在亞洲的東亞地區(qū)較高[5]。中國(guó)是一個(gè)結(jié)核病高發(fā)病率的國(guó)家，也是北京基因型菌株高比例的地區(qū)。在我國(guó)北方，北京基因型菌株占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，可以達(dá)到70%-80%，在中國(guó)香港、中國(guó)臺(tái)灣所占比例分別為70%和44.5%[6-7]。它具有高毒力特點(diǎn)，引起抑制和逃逸宿主免疫，易致耐藥、結(jié)核復(fù)發(fā)。既往研究表明北京基因型菌株與結(jié)核耐藥有密切關(guān)系，但各地區(qū)研究結(jié)果不盡相同，本研究采用RD105缺失基因檢測(cè)法鑒定北京基因型MTB、Xpert MTB/RIF檢測(cè)法鑒定耐利福平結(jié)核分枝桿菌，探討株洲北京基因型MTB的流行情況、易感因素及與耐利福平結(jié)核分枝桿菌菌株的相關(guān)性。

資料與方法

一、對(duì)象

收集株洲市2014年5月至2016年8月到中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院結(jié)核門診就診患者為研究對(duì)象。該研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與研究者均簽署知情同意書。入選患者156例，其中男82例，女74例，初治93例，復(fù)治63例，并發(fā)糖尿病61例，≤30歲33例，30-55歲54例，≥55歲69例。

1 入選標(biāo)準(zhǔn)：至少具有以下三項(xiàng)：① 有午后低熱、咳嗽、咯血、盜汗、乏力等典型肺結(jié)核感染臨床表現(xiàn)，癥狀超過2周；② 有肺結(jié)核典型影像學(xué)改變；③ 痰涂片抗酸染色陽(yáng)性；④ 支氣管或肺部組織病檢支持結(jié)核性改變；⑤ 痰培養(yǎng)為結(jié)核分枝桿菌[8]。

2 排除標(biāo)準(zhǔn)：① 在外院已行菌種培養(yǎng)鑒定明確為耐多藥結(jié)核感染者；② 標(biāo)本不合格者。

二、方法

1 痰抗酸染色法：收集患者清晨痰液，依據(jù)《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南(2008年版)》進(jìn)行抗酸染色[9]，抗酸染色陽(yáng)性痰液送羅氏培養(yǎng)。

2 羅氏固體培養(yǎng)：痰培養(yǎng)采用4%氫氧化鈉處理分離培養(yǎng)。吸取痰標(biāo)本到前處理管中，加入4%氫氧化鈉前處理液充分混勻，靜置15min后取吸管吸取前處理液均勻接種在培養(yǎng)基斜面上，觀察培養(yǎng)情況，記錄生長(zhǎng)結(jié)果[10-11]。

3 菌株DNA制備：將生長(zhǎng)形態(tài)良好的菌體溶于500ulTE緩沖液(PH值為8.0)中，80℃、30min滅活，煮沸10min，1200r/min離心2min，取上清備用(-20℃冷凍保存)。

4 北京基因型MTB鑒定：北京家族菌株的鑒定采用RD105缺失基因檢測(cè)法。上游引物序列為RD105-P1 GGAGTCGTTGAGGGTGTTCATCAGCTCAGTCCGGT,下游引物序列為RD105-P2 CGCCAAGGCCGCATAGTCACGGTCG和RD105-P3 GGTTGCCCACTGGTCGATATGGTGGACTT。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 30s,25個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7min。在1.5%瓊脂糖凝膠電泳下閱讀結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為786bp，該菌株為北京基因型；若擴(kuò)增產(chǎn)物片段為1495bp，該菌株為非北京基因型[12]。

5 Xpert MTB/RIF檢測(cè)：取菌株標(biāo)本與含氫氧化鈉及異丙醇的處理液混合，在渦旋震蕩器上震蕩15-30s，室溫靜置15min。取混合液2mL轉(zhuǎn)移至一次性多室塑料反應(yīng)盒中，然后將反應(yīng)盒放置到檢測(cè)模塊，儀器進(jìn)行自動(dòng)化分析[13]。

三、統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、菌株培養(yǎng)分型結(jié)果

從158例痰標(biāo)本中培養(yǎng)出150株陽(yáng)性菌株，MTB菌株142株，非MTB菌株8株。在142株MTB菌株中，北京基因型MTB 51例，非北京基因型91例。其中男74例，女68例，初治87例，復(fù)治55例，并發(fā)糖尿病61例，≤30歲30例，30-55歲52例，≥55歲60例(見表1)。

表1 142例MTB菌株分型結(jié)果(例)

二、北京基因型MTB的易感因素

女性患者的北京基因型MTB(38/68，55.8%)明顯高于男性患者的北京基因型MTB(13/74，17.5%)，復(fù)治患者北京基因型MTB(26/55，47.2%)明顯高于初治北京基因型MTB(18/87，20.6%)，糖尿病患者北京基因型MTB(32/61，52.4%)明顯高于非糖尿病患者北京基因型MTB(19/81，23.4%)，年齡≥55歲的患者北京基因型MTB(31/60，51.6%)明顯高于年齡≤30歲的患者北京基因型MTB(4/30，13.3%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三、北京基因型MTB與耐利福平的關(guān)系

通過Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耐利福平菌株48例，其中北京基因型MTB40例，非北京基因型8例。耐利福平患者北京基因型MTB(40/48，83.3%)明顯高于非耐利福平患者北京基因型MTB(11/94，11.7%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。(見表2)。

表2 142例MTB菌株Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果分析(例)

討 論

北京基因型MTB在世界各地流行廣泛，不同地域差別明顯，在亞洲較為流行。它與多耐藥密切相關(guān)，被懷疑是獲得耐藥性優(yōu)勢(shì)的進(jìn)化譜系。一旦有一株耐多藥，治療就變得困難、復(fù)雜，且更易造成結(jié)核傳染播散[14]。因此，研究北京基因型菌株的分布和傳播規(guī)律，探討其與耐藥的相關(guān)性，對(duì)結(jié)核病的控制具有重要意義。

RD105缺失基因檢測(cè)法是一種基于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群長(zhǎng)片段序列多態(tài)性(large sequence polymorphisms，LSPs)分析對(duì)北京家族菌株進(jìn)行鑒定的新方法[15-16]。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、費(fèi)用低廉，且準(zhǔn)確可靠，為北京基因型進(jìn)行鑒定的篩選方法[17]。本研究釆用RD105缺失基因檢測(cè)法鑒定北京家族菌株，在142株MTB菌株中，北京基因型MTB 51例，非北京基因型61例。北京基因型MTB所占比例為35.9%，低于我國(guó)北方、香港、臺(tái)灣，提示北京基因型MTB在地區(qū)發(fā)布有一定的差異性，但樣本量較少，不能進(jìn)行有效統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本次研究中女性患者的北京基因型MTB(38/68，55.8%)明顯高于男性患者的北京基因型MTB(13/74，17.5%)，復(fù)治患者北京基因型MTB(26/55，47.2%)明顯高于初治北京基因型MTB(18/87，20.6%)，糖尿病患者北京基因型MTB(32/61，52.4%)明顯高于非糖尿病患者北京基因型MTB(19/81，23.4%)，年齡≥55歲的患者北京基因型MTB(31/60，51.6%)明顯高于年齡≤30歲的患者北京基因型MTB(4/30，13.3%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示女性、高齡、復(fù)治患者、并發(fā)糖尿病患者可能是感染北京基因型MTB的易感因素，可能為宿主免疫反應(yīng)低下，不足以刺激Th1細(xì)胞及阻止細(xì)菌的大量繁殖，導(dǎo)致宿主易感。

Xpert MTB/RIF檢測(cè)法是世界衛(wèi)生組織為遏制結(jié)核病推薦的檢驗(yàn)方法[18]，是以半巢式實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，以rpob基因?yàn)榘谢?，自?dòng)提取DNA后擴(kuò)增rpob基因的81bp片段進(jìn)行檢測(cè)，2小時(shí)內(nèi)可檢測(cè)出MTB是否對(duì)利福平耐藥[19-22]。由于大部分利福平耐藥菌株同時(shí)對(duì)異煙肼耐藥，故利福平耐藥情況可以在一定程度上可作為耐多藥結(jié)核病的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。通過Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耐利福平菌株48例，其中北京基因型MTB 40例，非北京基因型8例。耐利福平患者北京基因型MTB(40/48，83.3%)明顯高于非耐利福平患者北京基因型MTB(11/94，11.7%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。北京基因型MTB被認(rèn)為是獲得耐藥性優(yōu)勢(shì)的進(jìn)化譜系，與耐藥相關(guān)密切，但不同國(guó)家和地區(qū)各不同。本次研究中，耐利福平患者北京基因型MTB(40/48，83.3%)明顯高于非耐利福平患者北京基因型MTB(11/94，11.7%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而耐利福平患者大多數(shù)情況下伴隨耐異煙肼，很少有單獨(dú)耐利福平的報(bào)道。研究北京基因型MTB對(duì)耐藥結(jié)核病傳播有重要的意義，本研究提示北京基因型MTB對(duì)株洲地區(qū)耐藥結(jié)核的流行有著重要的意義，可能是耐藥結(jié)核病傳播的優(yōu)勢(shì)菌群，應(yīng)重視并做好流行病學(xué)追蹤。本次研究運(yùn)用現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)和分子生物學(xué)方法分析了株洲北京基因型結(jié)核分枝桿菌菌株的流行情況和與耐利福平結(jié)核分枝桿菌菌株的相關(guān)性，為株洲耐藥結(jié)核病的防治提供參考依據(jù)，并對(duì)耐藥結(jié)核病人群的監(jiān)測(cè)具有重要意義。但由于結(jié)核病具有潛伏感染的特點(diǎn)，其發(fā)病和傳播具有復(fù)雜性，北京基因型MTB的耐藥機(jī)理、體內(nèi)感染機(jī)制、流行病學(xué)特點(diǎn)等問題目前仍尚不清楚，需要進(jìn)一步的大樣本研究。

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Correlative research between Beijing genotypes MTB infection in Zhuzhou and rifampin resistance

TAN Ying-zheng, CHEN Shuang-hua, XIAO Peng-cheng, LI Dan, FU Jing-li, LONG Yun-zhu

Department of Infections Diseases, Zhuzhou Affiliated Hospital of Xiangya Medical College of Central South University, Zhuzhou, Hunan 412007, China

Objective To explore the correlation between Beijing genotypes MTB infection in Zhuzhou and rifampin resistance. Methods 156 sputum specimens of tuberculosis with positive sputum anti-acid stain were collected from May 2014 to August 2016 in Zhuzhou, and they were given isolated culture and strain identification. The positive strains were given DNA extract, and Beijing genotypes MTB was identified by RD105 missing genetic test and rifampin resistance of MTB by Xpert MTB/test so as to analyze the association of Beijing genotypes with gender, age, diabetes, retreatment patients and rifampin resistance. Results 150 mycobacterium were cultivated among 156 sputum specimens, wherein there were 142 MTB strains and 8 non-MTB strains. The proportion of Beijing genotypes MTB of female patients (38/68, 55.8%) was apparently higher than that of male patients (13/74, 17.5%), and the proportion of Beijing genotypes MTB of retreated patients (26/55, 47.2%) was apparently higher than that of untreated patients (18/87, 20.6%), and the proportion of Beijing genotypes MTB of diabetes patients (32/61, 52.4%) was apparently higher than that of non-diabetes patients (19/81, 23.4%), and the proportion of Beijing genotypes MTB of patients over 55 years old (31/60, 51.6%) was apparently higher than that of patients below 30 (4/30, 13.3%) (P<0.05). Beijing genotypes MTB in rifampin-resistance strains (40/48, 83.3%) was obviously higher than that in non-rifampin resistance strains (11/94, 11.7%) (P<0.05). Conclusion Female, advanced age, diabetes and retreatment might be the risk factors of Beijing genotypes MTB infection. Beijing genotypes MTB is obviously associated with rifampin resistance.

Mycobacterium; tuberculosis; Rd105; rifampin resistance; Xpert MTB/RIF

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.08.040

1. 412007 湖南 株洲，中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院，感染內(nèi)科 2. 412012 湖南 株洲，湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校

龍?jiān)畦T，E-mail:346370009@qq.com

2016-11-24]