間歇低氧大鼠脂肪因子chemerin的表達與糖脂代謝關系研究

趙宏 汪小亞 張秀麗 李娟芝 劉佳銀 余勤

·論 著·

間歇低氧大鼠脂肪因子chemerin的表達與糖脂代謝關系研究

趙宏1汪小亞2張秀麗1李娟芝1劉佳銀1余勤2

目的 通過檢測間歇低氧大鼠血清chemerin的表達水平，探討脂肪因子chemerin在OSAHS相關糖脂代謝紊亂中的作用。方法 選取健康雄性Wistar大鼠24只隨機分4組：常氧+普通飲食組(NC+ND組)、常氧+高脂飲食組(NC+HFD組)、間歇低氧+普通飲食組(IH+ND組)、間歇低氧+高脂飲食組(IH+HFD組)。ND組給予基礎飼料喂養(yǎng)，HFD組予以高脂飼料喂養(yǎng)。IH組暴露于8h/d的間歇低氧環(huán)境中，同時NC組給予間歇壓縮空氣。檢測大鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)水平，用穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(IRI)及胰島素敏感指數(ISI)系統(tǒng)評價胰島素抵抗，ELISA法檢測大鼠血清chemerin的表達。結果 與NC+ND組比較，IH+ND組大鼠FPG、FINS、IRI、TC、TG、LDL-C升高有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；IH+HFD組大鼠血清FPG、TC、LDL-C水平高于IH+ND組，血清FINS、IRI水平高于NC+HFD組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與NC+ND組比較，IH+ND組大鼠血清chemerin水平升高有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；IH+HFD組大鼠血清chemerin水平高于IH+ND組和NC+HFD組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Pearson分析顯示：IH組大鼠血清chemerin與FPG(r=0.751，P<0.01)、FINS(r=0.764，P<0.01)、IRI(r=0.765，P<0.01)、TC(r=0.791，P<0.01)、LDL-C(r=0.818，P<0.01)呈正相關，與ISI(r=-0.692，P<0.01)呈負相關。結論 間歇低氧大鼠存在血糖、血脂代謝紊亂，且間歇低氧合并高脂飲食時，大鼠糖脂代謝紊亂更為嚴重；間歇低氧大鼠血清chemerin水平有升高趨勢，合并高脂飲食時這種趨勢更為顯著；血清chemerin水平變化與糖脂代謝紊亂相關，脂肪因子chemerin可作為OSAHS相關糖脂代謝紊亂的預測因子之一。

睡眠呼吸暫停；間歇低氧；Chemerin；胰島素抵抗；糖脂代謝

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合癥(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)以間歇低氧(intermittent hypoxia，IH)為主要特點，是一種可累及全身多系統(tǒng)損害的睡眠呼吸障礙性疾病，可引起糖脂代謝異常。Chemerin作為一種新發(fā)現的脂肪因子[1]，可通過促進脂肪分解、促進脂肪細胞分化、影響胰島素敏感性、參與胰島素抵抗等來調節(jié)糖脂代謝平衡。目前鮮有報道OSAHS相關糖脂代謝紊亂與脂肪因子chemerin的關系，本實驗通過建立模擬人OSAHS的慢性間歇低氧動物模型，來探討脂肪因子chemerin在間歇低氧相關糖脂代謝紊亂中的作用，為OSAHS相關代謝綜合征發(fā)病的研究提供新的思路。

資料與方法

一、材料

1 實驗動物：24只健康雄性Wistar大鼠，平均體重233.528±20.927g，鼠齡8周，由蘭州大學實驗動物中心提供，基礎飼料及動物墊料由蘭州大學實驗動物中心提供，實驗前于安靜環(huán)境、自然光照、溫度20℃-26℃、日溫差≤4℃、濕度40%-60%條件下適應性喂養(yǎng)1周。

2.主要試劑：葡萄糖檢測試劑盒(上海榮盛生物技術有限公司)，胰島素檢測試劑盒(天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司)，大鼠chemerin ELISA檢測試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿有限公司)。

3.主要儀器設備：參照文獻[2-3]設計間歇低氧大鼠模型，該模型由硬件設備與控制設備組成。硬件設備：IH環(huán)境模擬艙、動物飼養(yǎng)艙、電磁式空氣壓縮機、氧氣鋼瓶、氮氣鋼瓶、氣體輸送管道；控制設備：氣體減壓閥、電磁閥、氣體流量控制計、數顯時間繼電器。間歇低氧組程序設定為每一循環(huán)周期120s，即40s低氧期和80s復氧期，每小時循環(huán)30次。首先為40s的低氧期，前30s向模擬艙內輸入純氮氣，使模擬艙內氧濃度由21%逐漸降至6%-7%，后10s為靜息期，無氣體輸入，維持艙內氧濃度穩(wěn)定于6%-7%，形成低氧暴露；低氧期結束后進入80s復氧期，向模擬艙內輸入純氧氣20s，待艙內氧濃度逐漸升高至21%，持續(xù)輸入60s壓縮空氣，使艙內氧濃度維持在21%左右，形成常氧環(huán)境，如此循環(huán)。常氧組程序設定為向動物飼養(yǎng)艙內間歇輸入正?？諝?，輸入時間及流量同間歇低氧組。各艙內氧濃度由CY-12C測氧儀實時監(jiān)控。醫(yī)用氧氣、高純度氮氣由甘肅省蘭州方圓建化有限責任公司提供，CY-12C測氧儀由浙江省建德市梅城電化學分析儀器廠提供。

二、方法

1 動物分組及模型建立：24只健康雄性Wistar大鼠，按隨機數字表法分4組：常氧+普通飲食組(NC+ND)、常氧+高脂飲食組(NC+HFD)、間歇低氧+普通飲食組(IH+ND)、間歇低氧+高脂飲食組(IH+HFD)，每組6只。普通飲食組給予基礎飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組予以高脂飼料(豬油10%、膽固醇2%、蛋黃粉5%、丙基硫氧嘧啶0.2%、蔗糖10%、基礎飼料72.8%)喂養(yǎng)，高脂飼料由北京博泰宏達公司提供。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，每日9時至17時將IH組置于模擬艙內，NC組置于飼養(yǎng)艙內，暴露期間自然光照、自由飲水，建模時間6周，此過程中無實驗動物死亡。本實驗設計符合蘭州大學第一醫(yī)院動物實驗倫理學標準。

2 標本采集：實驗6周末將空腹12h的大鼠常規(guī)稱重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，固定于實驗臺上，沿腹部正中線切口依次打開腹腔各層組織，暴露腹主動脈，真空采血管采血后高速離心機(湘儀，中國湖南)在4℃下3000r/min離心15min，收集上清液分裝，分別保存于4℃與-20℃冰箱用于血脂、血糖和胰島素檢測。取血樣置于高速離心機(湘儀，中國湖南，參數：離心力=1000g/分鐘，時間=5分鐘，溫度=4℃)離心，分離血樣的上層清液并儲存于-20℃行血清chemerin檢測。

3 血脂、空腹血糖及空腹胰島素檢測：取血清樣品送蘭州大學第一醫(yī)院檢驗科，使用全自動生化分析儀檢測甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，取血清樣品送內分泌研究中心，葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖(FPG)及放射免疫分析法檢測空腹胰島素(FINS)水平，計算IRI與ISI評價胰島素抵抗及敏感性程度。

4 ELISA法測定血清chemerin表達：取血清樣品，根據制造商說明書采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清chemerin濃度。使用標準chemerin的稀釋液(15.6pg/mL-1000pg/mL)繪制標準曲線。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、各組大鼠糖脂代謝指標水平比較

IH+ND組大鼠FPG、FINS、IRI、TC、TG、LDL-C水平均高于NC+ND組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。IH+HFD組大鼠血清FPG水平(15.078±2.824 mmol/L)高于 IH+ND組(12.651±1.314 mmol/L)，血清TC水平(6.074±1.032 mmol/L)高于IH+ND組(4.134±0.582 mmol/L)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，血清LDL-C水平(3.710±0.527mmol/L)高于IH+ND組(2.182±0.413 mmol/L)，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。余各項指標均無統(tǒng)計學意義。IH+HFD組大鼠血清FINS水平(32.999±10.470 mIU/L)高于NC+HFD組(20.163±3.412 mIU/L)，IRI 水平(23.404±11.831)高于NC+HFD組(10.112±4.680)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各項指標均無統(tǒng)計學意義。(見表1)。

二、各組大鼠血清chemerin水平比較

IH+ND組大鼠血清chemerin水平(460.772±13.326 pg/mL)高于NC+ND組(412.840±25.201 pg/mL)，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。IH+HFD組大鼠血清chemerin水平(479.301±8.826 pg/mL)高于NC+HFD組(453.552±11.131 pg/mL)，亦高于IH+ND組(460.772±13.326 pg/mL)，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。其余各項指標均無統(tǒng)計學意義。(見表2)。

表1 各組大鼠檢測指標水平

注：*P<0.01與NC+ND組相比，**P<0.05與IH+ND組相比，***P<0.01與IH+ND組相比，#P<0.05與NC+HFD組相比。

表2 各組大鼠chemerin水平比較

注：*P<0.01與NC+ND組相比，***P<0.01與IH+ND組相比，##P<0.01與NC+HFD組相比。

表3 血清chemerin與各參數的相關性分析

討 論

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合癥(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)是一種臨床常見的睡眠呼吸障礙性疾病，具有多系統(tǒng)損害的特點。OSAHS相關心血管疾病因其較高的發(fā)病率與致死率，廣受研究者的重視，而近年來一些學者的研究顯示，與睡眠呼吸障礙相關的糖脂代謝紊亂的發(fā)生率亦較高，是OSAHS相關代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)的重要危險因素，嚴重威脅人群健康，成為目前研究熱點。

OSAHS引起的糖代謝異常，早期可表現為胰島素抵抗，進而出現糖耐量減低及臨床糖尿病。本研究中間歇低氧組大鼠血清FPG、FINS、IRI水平均高于常氧組，間歇低氧合并高脂組大鼠血清FINS、IRI水平高于常氧合并高脂組，差異均有統(tǒng)計學意義，說明OSAHS可引起較高的胰島素水平和胰島素抵抗。Polak與其研究團隊發(fā)現[4]，C57BL6/J小鼠暴露在IH環(huán)境14天可誘導IR的產生，并伴胰島素敏感性下降、胰島β細胞功能受損及胰腺氧化應激的增強，Lindberg等[5]研究發(fā)現，OSAHS患者胰島素敏感性下降程度與睡眠呼吸暫停低通氣指數(apnea hyponea index，AHI)顯著相關，這與我們本實驗結果相符。胰島素具有促進脂肪合成，抑制脂肪分解和脂肪酸氧化，減少血漿游離脂肪酸水平等作用，高胰島素血癥在肥胖起始發(fā)病中具有重要的作用，而IR目前被認為可能是OSAHS相關并發(fā)癥，如肥胖、糖尿病及脂質代謝紊亂等共同的發(fā)病機制之一。OSAHS可引起血脂代謝異常，Kono等[6]研究認為，OSAHS患者血脂異常發(fā)生率為48%，而對照組僅為25%，多元回歸分析顯示AHI是OSAHS患者發(fā)生高脂血癥的預測因子。本研究結果顯示，OSAHS可能具有上調血脂的作用，血脂代謝異?？杀憩F為間歇低氧組大鼠總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的升高，而血脂代謝紊亂可參與代謝綜合征的發(fā)生。一項臨床薈萃分析[7]顯示，OSAHS患者發(fā)生MS的危險性是非OSAHS患者的3.561倍，與未合并MS的患者相比，合并MS的患者TG、FPG均顯著增高。本研究亦發(fā)現，間歇低氧合并高脂組大鼠空腹血糖、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平均高于間歇低氧合并普食組大鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而一項針對正常體重OSAHS及OSAHS合并肥胖患者的臨床研究[8]也得出相同的結論。同時，在我們的研究中，間歇低氧合并高脂組大鼠IRI、FINS水平高于常氧合并高脂組大鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，OSAHS合并肥胖時，可加重糖脂代謝紊亂，可能增加MS的發(fā)生風險，肥胖合并OSAHS時，可進一步加重IR，同樣增加MS的發(fā)生風險。

OSAHS可引起脂肪代謝紊亂，而由脂肪組織分泌的chemerin，是2007年Bozaoglu等[1]用信號序列捕獲技術首次確定的一種脂肪因子，高度表達于白色脂肪組織、肝臟和肺，以旁分泌、自分泌或滋養(yǎng)血管分泌等多種方式作用于機體，不僅參與脂肪細胞的分化、成熟與代謝，亦可影響糖脂代謝、參與免疫應答、炎癥反應等，在OSAHS的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在本研究結果中，間歇低氧組大鼠血清chemerin水平明顯高于常氧組，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，并且兩組間FPG、FINS、IRI、TC、TG、LDL-C水平差異亦有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。究其潛在機制，Chemerin在脂肪細胞分化過程中能對脂肪酸合成酶、葡萄糖轉運蛋白-4、脂聯(lián)素受體等進行調控[9]，并降低糖原合成激酶3(GSK3)和蛋白激酶的磷酸化，影響外周組織對葡萄糖的吸收攝取，促進空腹血糖升高及肥胖發(fā)生，從而參與糖脂代謝平衡調節(jié)，與代謝綜合征的發(fā)病相關[1]。

肥胖是一種慢性炎性疾病[10]，是OSAHS最重要的危險因素之一。OSAHS可能通過增強炎性易感基因的表達和炎性細胞因子的合成[11]，促進肥胖炎癥反應的進展，導致肥胖的增加[12]，而脂肪因子chemerin在肥胖和OSAHS相互影響的過程中發(fā)揮重要作用[13]。本文研究結果中，Chemerin水平的改變與肥胖有關，間歇低氧合并高脂組大鼠血清chemerin水平明顯高于間歇低氧合并普食組，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與Ress等[14]報道一致。因此認為，chemerin系擔任聯(lián)系肥胖和OSAHS的角色，可被認為是OSAHS發(fā)生、發(fā)展的新生物標志物。此外，兩組大鼠血清TC、LDL-C水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，行Pearson分析后發(fā)現，間歇低氧組大鼠血清chemerin水平與TC、LDL-C呈顯著正相關，得出chemerin可加劇OSAHS并發(fā)的脂代謝紊亂，并進一步加劇OSAHS合并肥胖的脂代謝紊亂。因此認為，chemerin與OSAHS相關脂質代謝異常有密切聯(lián)系，chemerin可通過血脂紊亂參與OSAHS的發(fā)生、發(fā)展。同時，本研究發(fā)現間歇低氧組大鼠血清chemerin水平與空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗性呈顯著正相關，而與胰島素敏感性呈顯著負相關。該研究結果與臨床研究[15]一致，脂肪因子chemerin可能通過TNF-κB途徑介導的炎癥反應誘導OSAHS相關IR的發(fā)生[16]。由此可見，血漿chemerin 水平與MS的主要組成部分具有明顯相關性，chemerin可能參與了OSAHS相關MS的病理生理過程。

綜上所述，脂肪因子chemerin在大鼠間歇低氧相關糖脂代謝紊亂中具有重要作用，chemerin可能通過肥胖、胰島素抵抗和血脂代謝紊亂參與OSAHS的發(fā)生、發(fā)展，因此可作為早期預測OSAHS相關MS發(fā)生的脂肪因子，但chemerin 影響糖脂代謝的作用機制及具體信號轉導途徑尚不清楚。目前，關于脂肪細胞因子chemerin的研究還處于初始階段，它在OSAHS相關MS中的作用有待于進一步研究和明確。對chemerin的深入研究，將為提前預防、臨床診斷和治療OSAHS相關代謝綜合征疾病提供新的思路。

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Relationship between the expression of adipokines chemerin and glucose and lipid metabolism in rats during intermittent hypoxia

ZHAO Hong, WANG Xiao-ya, ZHANG Xiu-li, LI Juan-zhi, LIU Jia-yin, YU Qin.

the First Clinical Medical College of Lanzhou University, Lanzhou, Gansu 730000, China

Objective To explore the role of adipokines chemerin in OSAHS-related glucose and lipid disorders by detecting the expression level of serum chemerin in rats during intermittent hypoxia. Methods A total of 24 healthy male Wistar rats were randomly divided into four groups: the NC+ND group (normoxic+normal diet), the NC+HFD group (normoxic+high fat diet), the IH+ND group (intermittent hypoxia+normal diet), and the IH+HFD group (intermittent hypoxia+high fat diet). The ND group was given basic diet, and the HFD group was given high-fat diet. The IH group was exposed to intermittent hypoxic environment of 8h/d, while the NC group

intermittent compressed air. The serum TC (total cholesterol), TG (triglyceride), LDL-C (low density lipoprotein cholesterol), FPG (fasting plasma glucose), and FINS (fasting insulin) were detected, and IR (insulin resistance) was evaluated systematically by the homeostasis model assessment of insulin resistance index (IRI) and insulin sensitive index (ISI). The expression of serum chemerin in rats were detected by ELISA. Results Compared with the NC+ND group, the serum FPG, FINS, IRI, TC, TG, and LDL-C levels increased significantly in the IH+ND group (P<0.01), the serum FPG, TC and LDL-C levels in the IH+HFD group were higher than in the IH+ND group, and the serum FINS and IRI were higher in the IH+HFD group than in the NC+HFD group (P<0.05). Compared with the NC+ND group, there was a significant rise in serum chemerin level (P<0.01). The serum chemerin level in the IH+HFD group were higher than the IH+ND group and the NC+HFD group (P<0.01). Pearson analysis showed that the serum chemerin in the IH group were positively correlated with FPG (r=0.751,P<0.01), FINS (r=0.764,P<0.01), IRI (r=0.765,P<0.01), TC (r=0.791,P<0.01), and LDL-C (r=0.818,P<0.01), and negatively correlated with ISI (r=-0.692,P<0.01). Conclusion There are glucose and lipid metabolism disorders in rats during intermittent hypoxia, and the phenomenon is more serious when fed with high fat diet. The serum chemerin level tends to increase in rats during intermittent hypoxia, and this trend is even more significant when fed with high fat diet. The serum chemerin is associated with glucose and lipid disorders. Adipokines chemerin could be one predictor of OSAHS related glucose and lipid metabolism disorders.

sleep apnea; intermittent hypoxia; insulin resistance; chemerin; glucose and lipid metabolism

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.08.002

甘肅省自然科學基金項目(No 1506RJZA254)

1. 730000 甘肅 蘭州，蘭州大學第一臨床醫(yī)學院 2. 730000 甘肅 蘭州，蘭州大學第一醫(yī)院呼吸科

余勤，E-mail：yuq701@163.com

2016-12-27]