低溫沼氣發(fā)酵細(xì)菌定向篩選及產(chǎn)氣效能研究

趙 光，郭 星，冀麗爽，鄧建民，馬 放

（1.遼寧工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧 錦州121001；2.黑龍江省海林農(nóng)場(chǎng)，黑龍江 海林157126；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 市政環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱15009）

低溫沼氣發(fā)酵細(xì)菌定向篩選及產(chǎn)氣效能研究

趙 光1,3，郭 星1，冀麗爽1，鄧建民2，馬 放3

（1.遼寧工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，遼寧 錦州121001；2.黑龍江省海林農(nóng)場(chǎng)，黑龍江 海林157126；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 市政環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱15009）

為實(shí)現(xiàn)低溫生物甲烷高效轉(zhuǎn)化與發(fā)酵系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行，應(yīng)探索提高低溫沼氣發(fā)酵細(xì)菌代謝能力途徑與冷適機(jī)制。研究以發(fā)酵溫度（10、15、18、22、25°C和30°C）為驅(qū)動(dòng)因子，人工培養(yǎng)基定向富集自然低溫生境混合菌群，考察沼氣發(fā)酵細(xì)菌低溫生物甲烷轉(zhuǎn)化效能，并耦合454高通量測(cè)序和PCR-DGGE解析低溫混合菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，低溫生境混合細(xì)菌最優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群為ClostridiumXI sp.，占細(xì)菌總數(shù)的40.9%，確定分類地位的產(chǎn)甲烷菌有Methanosaetasp.和Methanobacteriumsp.。低溫沼氣發(fā)酵細(xì)菌在18°C富集培養(yǎng)的沼氣產(chǎn)量最高，可達(dá)220 ml L-1reactord-1，甲烷含量為56.8%。

低溫；沼氣發(fā)酵；嗜冷產(chǎn)甲烷菌；454焦磷酸測(cè)序技術(shù)

有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣技術(shù)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用早已得到世界各國(guó)的高度重視，并取得了良好的收益[1-2]。但是，在高緯度地區(qū)，由于冬季低溫的制約，目前尚未作為清潔能源的載體得到廣泛應(yīng)用。探尋低溫沼氣發(fā)酵抑制機(jī)理，促進(jìn)微生物代謝活性，開(kāi)發(fā)新工藝及沼氣發(fā)酵菌群生態(tài)調(diào)控技術(shù)，將是實(shí)現(xiàn)寒區(qū)沼氣能源產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。

低溫對(duì)沼氣發(fā)酵抑制的本質(zhì)是沼氣發(fā)酵微代謝活性的降低[3-4]。目前，有關(guān)低溫沼氣發(fā)酵的理論研究主要集中四個(gè)方面，低溫產(chǎn)甲烷菌的篩選、沼氣發(fā)酵微生物的分子生物學(xué)篩選、厭氧發(fā)酵工藝生態(tài)因子的優(yōu)化以及沼氣發(fā)酵促進(jìn)劑的開(kāi)發(fā)等[5-8]。由于沼氣發(fā)酵是一個(gè)十分復(fù)雜的厭氧菌代謝過(guò)程，且研究表明低溫產(chǎn)甲烷是厭氧菌的遺傳生理代謝功能，并不是某種功能逃避機(jī)制[9-10]。僅依靠調(diào)控產(chǎn)甲烷菌的代謝活性并不能高效驅(qū)動(dòng)低溫條件下有機(jī)物的甲烷轉(zhuǎn)化效率。因此，從根本上解決低溫生物甲烷高效制備，提高沼氣發(fā)酵細(xì)菌的群體協(xié)同代謝能力是關(guān)鍵，找到低溫協(xié)同高效產(chǎn)甲烷的厭氧菌群落結(jié)構(gòu)，或一些對(duì)低溫抗性較強(qiáng)的微生物類群，通過(guò)分離、生物強(qiáng)化等技術(shù)手段定向培養(yǎng)，進(jìn)而有效提高低溫甲烷轉(zhuǎn)化效率。

本研究采集自然生境低溫厭氧混合細(xì)菌，以溫度為驅(qū)動(dòng)因子，定向富集培養(yǎng)，考察低溫條件下的生物甲烷轉(zhuǎn)化效能，分析低溫沼氣發(fā)酵微生物特性。以期為實(shí)現(xiàn)低溫高效產(chǎn)甲烷的微生物代謝調(diào)控與厭氧發(fā)酵系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行提供科學(xué)參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 自然生境低溫混合細(xì)菌采集

低溫活性污泥采自位于黑龍江齊齊哈爾的克欽湖沼澤濕地（47°10′N,124°12′E），采集2 m深處活污泥，環(huán)境溫度為8℃。污泥轉(zhuǎn)移至冰盒厭氧袋內(nèi)，表面覆蓋90%濕地原生態(tài)湖水，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室4℃低溫保存。

1.2 培養(yǎng)基定向富集培養(yǎng)

本試驗(yàn)以250 mL厭氧瓶為發(fā)酵反應(yīng)器，活性污泥接種量為30%，配置150 mL甲烷菌富集培養(yǎng)基[11]，在15±0.1℃的低溫培養(yǎng)箱進(jìn)行定向富集，經(jīng)多次傳代富集培養(yǎng)，直至篩選出沼氣產(chǎn)量穩(wěn)定的產(chǎn)甲烷混合菌群。進(jìn)一步考察不同發(fā)酵溫度對(duì)定向篩選的復(fù)合產(chǎn)甲烷混合菌群產(chǎn)沼氣效能與甲烷含量。

1.3 試驗(yàn)方法

總固體含量（TS%）、可揮發(fā)性物質(zhì)（VS%）等按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)試[12]。pH采用上海雷磁pH-3C測(cè)定，沼氣產(chǎn)量采用排水法，甲烷含量測(cè)定應(yīng)用Agilent 6890氣象色譜完成。

低溫活性污泥細(xì)菌基因組總DNA先經(jīng)液氮研磨法前處理，再應(yīng)用細(xì)菌提取試劑盒（上海生工）進(jìn)行提取。采用美國(guó)ABI9700PCR儀擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3高變區(qū)，測(cè)序采用454 GX-FLX（羅氏公司）高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)菌生物多樣性評(píng)價(jià)及微生物群落組成分析[13-14]。產(chǎn)甲烷古菌V2-V3區(qū)擴(kuò)增使用通用引物對(duì)A109(T)-F和515GC-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng)用DGGE 30-50%的梯度膠進(jìn)行分離，所得序列結(jié)果通過(guò)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTX功能進(jìn)行分析比對(duì)[15-16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 低溫活性污泥細(xì)菌生物多樣性評(píng)價(jià)

提取活性污泥細(xì)菌基因組總DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用454 GX-FLX高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行生物多樣性評(píng)價(jià)和微生物群落組成分析，產(chǎn)甲烷古菌分析采用PCR-DGGE技術(shù)，凝膠切割回收后測(cè)序。

低溫混合細(xì)菌通過(guò)序列質(zhì)量篩選，共獲得高質(zhì)量細(xì)菌序列1015條，稀釋曲線如圖1所示，隨樣本測(cè)序量增加，序列不同相似水平上逐漸出現(xiàn)平緩趨勢(shì)，但仍未達(dá)飽和狀態(tài)。如表1所示，當(dāng)序列相似度為95%和97%時(shí)，樣品產(chǎn)生406個(gè)和452個(gè)OTU，覆蓋率分別為64.1%和68.7%，說(shuō)明低溫細(xì)菌至少存在406個(gè)細(xì)菌屬，細(xì)菌群落多樣性比較豐富。豐富度指數(shù)Chao1和ACE是反映物種群落豐欠狀況的指標(biāo)，計(jì)算結(jié)果表明，在序列相似度為95%的屬分類水平，Chao1和ACE分別為1 698和4 116。因此，測(cè)序數(shù)量未達(dá)到飽和，低溫活性污泥微生物多樣性較高，繼續(xù)擴(kuò)大測(cè)序通量仍可發(fā)現(xiàn)新的微生物類群。

圖1 低溫混合細(xì)菌稀釋曲線

表1 低溫混合細(xì)菌在不同分類水平多樣性及豐富度指數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.2 低溫沼氣發(fā)酵混合菌群落結(jié)構(gòu)分析

如圖2所示，低溫產(chǎn)甲烷混合細(xì)菌多樣性豐富，在門分類水平上屬于11個(gè)類群，主要包括：酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、Synergistetes門、螺旋體門（Spirochaetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、TM7門和厚壁菌門（Firmicutes）。優(yōu)勢(shì)類群為主要優(yōu)勢(shì)地位的微生物種群為Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria，相對(duì)豐度分別占細(xì)菌群落總數(shù)的68.47%、8.28%和7.88%。

圖2 低溫混合菌群在門分類水平的微生物組成

在屬分類水平，優(yōu)勢(shì)類群如表2所示（相對(duì)豐度＞1.0%），梭菌屬（ClostridiumXI sp.）為最優(yōu)勢(shì)類群占序列總數(shù)的40.99%，低溫混合細(xì)菌還包括一些相對(duì)豐度大于1%的微生物類群，如Turicibactersp.（4.14%）、Anaerobactersp.（3.55%）、Nakamurellasp.（3.05%）和Meniscussp.（1.48%）等。此外，還發(fā)現(xiàn)其他一些低豐度細(xì)菌類群存在，主要有Lutaonellasp.、Proteiniphilumsp.和Cellulosilyticumsp.等。產(chǎn)甲烷微生物的低溫產(chǎn)甲烷能力是其自身長(zhǎng)期進(jìn)化具備的遺傳生理代謝功能。由于低溫活性污泥取自克欽生態(tài)淺層湖底，常年處于低溫厭氧環(huán)境，周期性生長(zhǎng)蘆葦?shù)戎参铮研纬上鄬?duì)穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)，因此具有一定的低溫厭氧代謝能力。本研究結(jié)果與深?；钚晕勰嗟募?xì)菌多樣性具有顯著差異，如Feng等對(duì)東海的長(zhǎng)江口活性污泥微生物群落組成研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門（Proteobacteria）為最優(yōu)勢(shì)菌群占微生物序列總數(shù)的72.9%，其次為厚壁菌門（Firmicutes，6.4%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，4.6%），這種差異主要是低溫微生物常年的高壓環(huán)境與極度厭氧造成，形成其特殊的物質(zhì)能量代謝方式[17]。

為考察低溫活性污泥存在的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷古菌類型，對(duì)產(chǎn)甲烷古菌16S rRNAV2-V3區(qū)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳（DGGE）。DGGE圖譜如圖3所示，圖譜顯示14個(gè)優(yōu)勢(shì)條帶，對(duì)優(yōu)勢(shì)條帶切割并進(jìn)行DNA膠回收，基因克隆測(cè)序。由凝膠條帶亮度代表的相對(duì)豐度可知，Band 1、Band 4、Band 8、Band 10和Band 11為優(yōu)勢(shì)微生物類群，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，低溫產(chǎn)甲烷古菌可確定分類地位的只有Band1和Band8為Methanobacteriumsp.MB4(DQ677518)和Uncultured Methanomicrobiaceae archaeon(GU257173)，未發(fā)現(xiàn)乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，其他均為不能確定營(yíng)養(yǎng)代謝類型的產(chǎn)甲烷古菌（表2）。

表2 低溫混合細(xì)菌在屬分類水平的微生物組成

圖3 低溫產(chǎn)甲烷古菌PCR-DGGE圖譜

2.3 不同發(fā)酵溫度對(duì)低溫沼氣發(fā)酵混合菌群產(chǎn)氣能力影響

應(yīng)用人工產(chǎn)甲烷菌富集培養(yǎng)基，15℃定向富集低溫混合產(chǎn)甲烷活性污泥，以獲得穩(wěn)定沼氣產(chǎn)量為傳代起始標(biāo)準(zhǔn)，多次轉(zhuǎn)代直至得到最佳沼氣產(chǎn)量的混合微生物類群。進(jìn)一步考察選育的復(fù)合低溫產(chǎn)甲烷菌在不同溫度條件下的沼氣發(fā)酵能力。如圖4所示，經(jīng)8個(gè)周期富集培養(yǎng)，低溫產(chǎn)甲烷菌群的沼氣產(chǎn)量逐步穩(wěn)定，周期累計(jì)最高沼氣產(chǎn)量為180 mL，相比啟動(dòng)初期提高133.8%，甲烷含量為57.2%。如圖5所示，不同發(fā)酵溫度對(duì)篩選的穩(wěn)定低溫產(chǎn)甲烷混合菌群產(chǎn)沼氣能力影響，中溫30℃發(fā)酵對(duì)低溫混合菌群產(chǎn)甲烷具有抑制作用，低溫混合產(chǎn)甲烷菌的最大沼氣產(chǎn)量出現(xiàn)在18℃發(fā)酵，當(dāng)反應(yīng)器啟動(dòng)15 d時(shí)，沼氣產(chǎn)量達(dá)到峰值39 mL/d，最大有效容積沼氣產(chǎn)率約為0.22 m3m3reactord-1，測(cè)定甲烷含量為56.8%。

表3 甲烷菌16S rRNAV2-V3區(qū)優(yōu)勢(shì)微生物最相似序列

圖4 低溫混合菌群定向富集培養(yǎng)沼氣產(chǎn)量與甲烷濃度

圖5 低溫混合菌群不同發(fā)酵溫度下的沼氣產(chǎn)量

3 結(jié)論

（1）本研究在自然低溫生境篩選低溫產(chǎn)甲烷混合菌群，利用454焦磷酸高通量測(cè)序技術(shù)分析低溫產(chǎn)甲烷混合菌群多樣性，在細(xì)菌屬分類水平共得到406個(gè)OTU，覆蓋率為64.1%。

（2）聚類分析表明，F(xiàn)irmicutes屬最優(yōu)勢(shì)微生物類群，占細(xì)菌群落總數(shù)的68.47%，在屬分類水平，ClostridiumXI sp.為最優(yōu)勢(shì)微生物類群（40.99%），可確定分類地位的產(chǎn)甲烷菌為Methanobacteriumsp.和Uncultured Methanomicrobiaceae archaeon。

（3）利用人工培養(yǎng)基定向富集馴化，篩選的穩(wěn)定低溫混合產(chǎn)甲烷菌系在18°C時(shí)沼氣產(chǎn)量最大為0.22 m3m3reactord-1，甲烷含量為56.8%。

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責(zé)任編校：劉亞兵

Research on Oriented Enrichment of Psychrophilic Biogas-producing Bacteria and Methane Production

ZHAO Guang1,GUO Xing1,JI Li-shuang1,DENG Jian-min2,MAFang3

（1.Chemical and Environmental Engineering college,Liaoning University of Technology,Jinzhou121001,China;2.Hailin Farm,Hailin 150000,China; 3.School of Municipal Environmental Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China）

Improving the metabolic activity of psychrophilic biogas-producing bacteria is crucial to realize efficient biomethane conversion and stable operation of anaerobic digester under low temperature.The study adopts fermentation temperature(10、15、18、22、25°C and 30°C)as limited factor to investigate biogas conversion of psychrophilic bacteria cultivated from natural habitat using oriented enrichment of artificial medium.Furthermore,454 pyrosequencing technology and PCR-DGGE were employed to analyze microbial community diversity.The results show that the dominant psychrophilic bacteria isClostridiumXI sp.and accounts for 40.9%.TheMethanosaetasp.andMethanobacteriumsp.were detected from psychrophilic bacteria.The optimum biogas production was 220 ml L-3reactord-1and 56.8%of methane content operated under 18°C.

lowtemperature;biogas;psychrophilicmethanogen;454pyrosequencing technology

X705

A

1674-3261(2017)01-0048-04

2015-11-05

國(guó)家科技支撐計(jì)劃專題項(xiàng)目（2012BAD14B06-04）；遼寧省教育廳項(xiàng)目（L2014236）；遼寧工業(yè)大學(xué)教師科研啟動(dòng)基金（X201310）

趙光(1980-)，男，遼寧開(kāi)原人，副教授，博士。

10.15916/j.issn1674-3261.2017.01.013