中藥復(fù)方熄風(fēng)膠囊對難治性癲癇大鼠多藥耐藥基因MDR1mRNA表達(dá)的影響

陳會 李新民 路巖莉 孫丹 聶坤 房艷艷 任艷艷

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中藥復(fù)方熄風(fēng)膠囊對難治性癲癇大鼠多藥耐藥基因MDR1mRNA表達(dá)的影響

陳會 李新民 路巖莉 孫丹 聶坤 房艷艷 任艷艷

目的 探討中藥復(fù)方熄風(fēng)膠囊對氯化鋰—匹羅卡品致難治性癲癇模型大鼠腦組織MDR1mRNA表達(dá)的影響。方法 建立氯化鋰—匹羅卡品癲癇大鼠模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為8組：正常對照組(空白組)、模型對照組(模型組)、熄風(fēng)膠囊低劑量組(熄低組)、熄風(fēng)膠囊中劑量組(熄中組)、熄風(fēng)膠囊高劑量組(熄高組)、卡馬西平治療組(CBZ組)、熄風(fēng)膠囊中劑量+卡馬西平組(熄卡組)、熄風(fēng)膠囊中劑量+1/2卡馬西平組(熄卡低組)。熄低、中、高組分別予熄風(fēng)膠囊0.33 g、0.66 g、0.99 g，濃縮劑2 mL；CBZ組予CBZ 20 mg/kg；熄卡、熄卡低組分別予熄風(fēng)膠囊0.66 g和CBZ 20 mg/kg、CBZ 10 mg/kg；模型組和空白組分別予生理鹽水2 mL。每天上午灌胃一次，共持續(xù)60天。給藥結(jié)束后檢測各組大鼠腦組織MDR1mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，其余各組的MDR1mRNA的基因表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，熄中組、熄卡低組、熄卡組和CBZ組的MDR1mRNA表達(dá)均下降(P<0.05)；與CBZ組相比，熄卡低組和熄卡組的基因表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 熄中組、熄卡低組、熄卡組、CBZ組對MDR1mRNA表達(dá)有抑制作用，且熄卡低組和熄卡組對MDR1mRNA表達(dá)的抑制作用比單用卡馬西平作用更明顯。

中藥復(fù)方； 難治性癲癇； 多藥耐藥基因； 熄風(fēng)膠囊

難治性癲癇(intractable epilepsy,IE)是指頻繁的癲癇發(fā)作，每月至少4次以上，應(yīng)用適當(dāng)?shù)囊痪€抗癲癇藥物(anti-epilepsy drugs,AEDs)正規(guī)治療，藥物穩(wěn)態(tài)血濃度在有效治療范圍內(nèi)，無嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)；至少觀察2年，發(fā)作仍不能控制，影響日常生活；無進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或占位性病變。IE死亡率比一般癲癇高4～7倍，已成為危害公共健康的一個主要疾病。多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指由單一藥物誘發(fā)，同時對其他多種不同作用機(jī)制的藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。IE表現(xiàn)為對多種AEDS產(chǎn)生耐藥，臨床治療效果欠佳。本實(shí)驗(yàn)采用氯化鋰—匹羅卡品大鼠模型，通過檢測熄風(fēng)膠囊對大鼠腦組織多藥耐藥基因MDR1mRNA表達(dá)的影響，從基因水平進(jìn)一步探討難治性大鼠耐藥的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF級健康雄SD大鼠150只，體重(45±10) g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(軍)2012-0004。

1.2 藥品、試劑與儀器

氯化鋰(100 g/瓶，美國Sigma，公司批號：115K1308)、阿托品(5 mg/mL，天津金耀氨基酸有限公司，批號：H12020384)、鹽酸匹羅卡品(5 g/瓶，美國Sigma公司，批號：066k1730)、地西泮注射液(5 mg/mL，天津金耀氨基酸有限公司，批號：0804032)、熄風(fēng)膠囊[院內(nèi)制劑，藥物組成：紫河車12 g、石菖蒲12 g、天麻8 g、僵蠶4 g、郁金8 g、全蝎4 g、姜半夏8 g，0.33 g/粒，天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院杏林藥廠，批號：Z20010252、卡馬西平(200 mg/片，北京諾華制藥公司，批號：H11022279)。

無RNA酶的EPpendorf 管、液氮、-80℃冰箱、超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒、Ultra SYBR Mixture、DNase I均購自CW bio公司、熒光定量PCR儀(Bio-rad IQ5)。

1.3 造模方法

參照Honchar[1]和余倩等[2]人的方法：小劑量反復(fù)ip匹魯卡品制備難治性大鼠模型。將150只大鼠隨機(jī)分成兩大組，正常對照組10只，其余140只用于模型的建立。氯化鋰按127 mg/kg劑量進(jìn)行腹腔注射，18小時后硫酸阿托品1 mg/kg 腹腔注射以減少外周膽堿能作用，30分鐘后匹羅卡品30 mg/kg(濃度1%，首次20 mg/kg，30分鐘后10 mg/kg)腹腔注射，大鼠出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)1小時后，再給予腹腔注射地西泮10 mg/kg解除抽搐，如癇性發(fā)作不能緩解，可重復(fù)注射地西泮1～2次，直到癇性發(fā)作被解除。

1.4 模型評價(jià)及制備情況

驚厥評分采用Racine評分法[3]：癇性發(fā)作達(dá)到Ⅳ級及以上，持續(xù)時間超過30分鐘，解除癇性發(fā)作后狀態(tài)良好的大鼠為合格的模型。

本實(shí)驗(yàn)造模前大鼠共140只，其中34只出現(xiàn)0～Ⅲ級發(fā)作，表現(xiàn)為無反應(yīng)、耳面部抽搐、肌陣攣伴或不伴直立位等，為點(diǎn)燃不成功大鼠，予以剔除。造模后達(dá)到Ⅳ級及以上的大鼠共116只，在造模過程中由于癲癇頻繁發(fā)作死亡25只，在接下來的一周，大鼠的主要表現(xiàn)為精神萎靡、進(jìn)食活動少、消瘦，暫不給予藥物及生理鹽水等灌胃處理，予葡萄糖鹽水及水果碎片飼養(yǎng)加強(qiáng)營養(yǎng)支持。期間7只大鼠相繼死去，對剩余存活且精神狀態(tài)良好的84只大鼠，每組12只，分為7組，加空白組10只，共8組。

1.5 動物分組及灌胃計(jì)量

將造模成功的84只隨機(jī)分成7組，分別為模型對照組(模型組)、熄風(fēng)膠囊低劑量組(熄低組)、熄風(fēng)膠囊中劑量組(熄中組)、熄風(fēng)膠囊高劑量組(熄高組)、卡馬西平治療組(CBZ組)、熄風(fēng)膠囊中劑量+卡馬西平組(熄卡組)、熄風(fēng)膠囊中劑量+1/2卡馬西平組(熄卡低組)，每組大鼠12只。造模前隨機(jī)選取10只大鼠，作為正常對照組(空白組)。

其中熄低組：熄風(fēng)膠囊0.33 g，濃縮劑2 mL；熄中組：熄風(fēng)膠囊0.66 g，濃縮劑2 mL；熄高組：熄風(fēng)膠囊0.99 g，濃縮劑2 mL；CBZ治療組：CBZ 20 mg/kg；熄卡組：熄風(fēng)膠囊0.66 g，濃縮劑2 mL和CBZ 20 mg/kg；熄卡低組：熄風(fēng)膠囊0.66 g，濃縮劑2 mL和CBZ10 mg/kg；空白組和模型組給予生理鹽水2 mL。每天上午灌胃一次，共持續(xù)60天。

1.6 標(biāo)本制備及檢測方法

治療結(jié)束后，各組隨機(jī)選取4只大鼠，將大鼠迅速斷頭，剪開顱頂部皮膚，剝除顱骨，用高溫高壓消毒過的器械將鼠腦剜出，置于無菌冰盤，迅速剝離出雙側(cè)海馬及皮層置于無RNA酶的EPpendorf管中，標(biāo)記后放入液氮罐之內(nèi)暫存。隨后保存于-80℃冰箱。

采用超純RNA提取試劑盒提取總RNA：于樣品中加入1 mL上樣緩沖液，溶解后的RNA進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，待溴酚藍(lán)遷移至凝膠長度2/3時停止電泳，取出凝膠在紫外透射儀上觀察5、18和28秒條帶并攝影記錄。熒光實(shí)時定量多聚酶鏈反應(yīng)，根據(jù)小鼠全基因序列，在NCPI網(wǎng)上查找相關(guān)因基序列和內(nèi)參，利用Beacon designer 7軟件設(shè)計(jì)引物，以ABCB1A為目的的基因，以GAPDH為內(nèi)參。用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，總反應(yīng)體系20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件是：37℃孵育40分鐘，反應(yīng)結(jié)束后85℃保溫5分鐘。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。采用熒光定?PCR 儀，用 2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠癲癇性發(fā)作行為觀察結(jié)果

空白組未見抽搐發(fā)作，其余各實(shí)驗(yàn)組大鼠行為學(xué)都呈不同程度的改變，空白組未見反復(fù)自發(fā)性發(fā)作(spontaneousrecurrentepilepticseizure，SRS)發(fā)作，其余各實(shí)驗(yàn)組均有SRS發(fā)作；與模型組比較，各治療組SRS發(fā)作次數(shù)均低于模型組(P<0.05)；與CBZ組比較，熄卡組、熄卡低組SRS發(fā)作次數(shù)均低于CBZ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 熄風(fēng)膠囊對IE大鼠SRS次數(shù)影響的比較±s)

注： 與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與CBZ組比較，cP<0.05。

2.2 熄風(fēng)膠囊對IE大鼠腦組織MDR1mRNA表達(dá)水平的影響

2.2.1 基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線 選取樣本cDNA進(jìn)行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2 μL作模板，分別目的基因用ABCB1A引物和內(nèi)參基因GAPDH引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時在60～95℃進(jìn)行溶解曲線分析。從圖可見，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均達(dá)到0.99，說明線性相光度很高，而且擴(kuò)增效率均在90%以上，因此可以采用這種方法和上述引物對后續(xù)樣本進(jìn)行擴(kuò)增分析。見圖1。

2.2.2 熄風(fēng)膠囊對IE大鼠腦組織MDR1mRNA表達(dá)水平的影響比較 與空白組比較，其余各組大鼠MDR1mRNA的基因表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，熄中組、熄卡低組、熄卡組和CBZ組的MDR1mRNA表達(dá)均下降(P<0.05)；與CBZ組相比，熄卡低組和熄卡組的基因表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 熄風(fēng)膠囊對 IE 大鼠腦組織MDR1mRNA表達(dá)水平的影響比較±s)

注： 與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與CBZ組比較，cP<0.05。

注：A: ABCB1A基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖：上為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，橫坐標(biāo)代表標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)對數(shù)值，縱坐標(biāo)代表循環(huán)次數(shù)，下為溶解曲線圖，橫坐標(biāo)代表溶解溫度，縱坐標(biāo)代表熒光信號值;B: ABCB1A基因?qū)崟r擴(kuò)增曲線圖與產(chǎn)物溶解曲線圖，上為實(shí)時擴(kuò)增曲線圖，橫坐標(biāo)代表擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表扣除背景熒光后的熒光強(qiáng)度，下為溶解曲線圖，橫坐標(biāo)代表溶解溫度，縱坐標(biāo)代表單位時間內(nèi)的相對熒光強(qiáng)度;C:組織內(nèi)參GAPDH基因?qū)崟r擴(kuò)增曲線圖：上為實(shí)時擴(kuò)增曲線圖，橫坐標(biāo)代表擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表扣除背景熒光后的熒光強(qiáng)度，下為產(chǎn)物溶解曲線圖，橫坐標(biāo)代表溶解溫度，縱坐標(biāo)代表單位時間內(nèi)的相對熒光強(qiáng)度。

圖1 ABCB1A 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖

3 討論

多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體的過量表達(dá)，是IE耐藥形成的重要分子機(jī)制[4-5]。多藥耐藥基因表達(dá)產(chǎn)物的作用主要是將一些大分子親脂性物質(zhì)由胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，這是一個ATP依賴過程。很多治療藥物都是親脂性的，能夠成為此類基因表達(dá)產(chǎn)物的底物，被泵出胞外，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，稱為多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體[6-7]。

MDR是被發(fā)現(xiàn)的第一個與IE有關(guān)的耐藥基因。人類的MDR基因主要由MDR1和MDR2組成，其中MDR1起主要作用，編碼一種分子質(zhì)量為170kD的膜蛋白，即P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)。P-gp是由多藥耐藥基因編碼的ATP依賴性的藥物外排泵，存在于腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的腔面[8]。在癲癇的病理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮短暫破壞，引起星形膠質(zhì)細(xì)胞終足部位P-gp過度表達(dá)，構(gòu)成第二道屏障，增強(qiáng)血腦屏障功能，保護(hù)腦內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定，阻止AEDs進(jìn)入腦組織，降低AEDs在腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)濃度，導(dǎo)致治療失敗。P-gp的過度表達(dá)易造成癲癇耐藥，故在治療時加上P-gp抑制劑是治療IE的一個新概念。由于IE是一個需要聯(lián)合用藥和長期治療的疾病，所以用于治療IE的P-gp抑制劑應(yīng)當(dāng)具有高度特異且無毒性，對AEDs及其他藥物的代謝酶應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生最小的抑制作用。

近年來，由于中醫(yī)藥資源豐富及多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，中藥及中藥復(fù)方的P-gp抑制劑成為一個新的研究方向。柴胡皂苷a低、中、高劑量均可以降低氯化鋰-匹羅卡品致IE動物模型大鼠顳葉皮層、海馬區(qū)P-gp的過度表達(dá)，其效果成劑量依賴性[9]。劉新紅等[10]采用免疫組化方法檢測各組癲癇大鼠海馬CA3區(qū)P-gp和核因子-κB p65的表達(dá)水平，結(jié)果顯示小檗堿能夠延長癲癇發(fā)作潛伏期、降低其嚴(yán)重程度，并抑制癲癇大鼠腦組織P-gp的過度表達(dá)。有研究顯示[11]，雷公藤內(nèi)酯對海人酸致癇大鼠耐藥有逆轉(zhuǎn)作用，其機(jī)制與下調(diào)致癇大鼠海馬區(qū)P-gp的表達(dá)有關(guān)?；⒄溶沼幸欢ǖ目拱d癇作用，下調(diào)P-gp表達(dá)可能是機(jī)制之一[12]。

本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR方法檢測P-gp的編碼基因MDR1mRNA在實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織的表達(dá)水平，結(jié)果提示：在基因水平上，CBZ組、熄風(fēng)膠囊單藥的中劑量組、聯(lián)合用藥的熄卡低組和熄卡組對IE大鼠腦組織MDR1mRNA表達(dá)均具有明顯的抑制作用，并且中西藥聯(lián)合比單用西藥抑制作用更明顯，這為研究IE耐藥機(jī)制的中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)研究及臨床治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Effect of the Chinese herbal compoundXifengcapsule on expression of MDR1mRNA of intractable epilepsy rats

CHENHui，LIXinmin，LUYanli，etal.

DepartmentofPaediatrics，TheFirstTeachingHospitalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，TianJin300193，China

LIXinmin，E-mail:tjtcmlxm@163.com

Objective To study the effect of Chinese herbal compoundXifengcapsule on different expression of MDR1mRNA in the brain tissue of epileptic rats induced by lithium chloride-pilocar. Methods Epileptic rat model was established by lithium chloride-pilocarpine. Rats were randomly divided into eight groups: normal control group, model control group,Xifengcapsule low-dose treatment group (Xifenglow-dose group),Xifengcapsule middle-dose treatment group (Xifengmiddle-dose group),Xifengcapsule high-dose treatment group (Xifenghigh-dose group), carbamazepine treatment group(CBZ group),Xifengmiddle-dose + carbamazepine treatment group (xi-car group),Xifengcapsule middle-dose+1/2dose carbamazepine treatment (xi-car low group).Xifenglow, medium and high group was respectively given 0.33 g, 0.66 g and 0.99 g, thickening agent 2 mL; CBZ dose group was given CBZ 20 mg/kg; Xi-car and Xi-car low group was respectively givenXifengcapsule 0.66g thickening agentr 2mL and CBZ 20mg/kg, CBZ 10mg/kg; normal control group and model control group was respectively given 2 mL saline solution. The rats were intragastric administration once a day in the morning for 60 days. The MDR1mRNA expression of each group was detected. Result Real-time RT-PCR results showed that: comparing with normal control group, the expression of MDR1mRNA in the rest groups were up-regulation.Comparing with model group, the expression of MDR1mRNA of the CBZ group，Xifengmiddle-dosegroup，Xifengmiddle-dose+CBZ groupandXifengmiddle-dose+1/2 CBZ group was declined(P<0.05). Comparing with CBZ group，the expression of MDR1mRNA ofXifengmiddle-dose+CBZ groupandXifengmiddle-dose+1/2 CBZ group was declined(P<0.05). Conclusion The CBZ group，Xifengmiddle-dosegroup，Xifengmiddle-dose+CBZ group andXifengmiddle-dose+1/2 CBZ group had inhibitory effect on the expression of MDR1mRNA, andXifengmiddle-dose group，the inhibitory effect ofXifengmiddle-dose+1/2 CBZ group is more obvious than CBZ group.

Chinese herbal； Intractable epilepsy； MDR1mRNA；Xifengcapsule

國家自然科學(xué)基金(81373690)

300193 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科(陳會、李新民、路巖莉、孫丹、聶坤 )；天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院[房艷艷(博士研究生)]；山東省鄒城市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心(任艷艷)

陳會(1985- )，女，博士，住院醫(yī)師。研究方向：小兒癲癇及肺系疾病。E-mail：chenhui8586@163.com

李新民(1964- )，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：小兒癲癇及肺系疾病。E-mail：tjtcmlxm@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.07.004

2016-09-06)