藜麥醇提物提取工藝的正交優(yōu)化及其抑菌性研究

徐 瀾,曹 維

（忻州師范學(xué)院 生物系，山西 忻州 034000）

藜麥醇提物提取工藝的正交優(yōu)化及其抑菌性研究

徐 瀾,曹 維

（忻州師范學(xué)院 生物系，山西 忻州 034000）

采用微波輔助法對(duì)藜麥醇提物的提取工藝進(jìn)行正交優(yōu)化，并探討了藜麥醇提物的抑菌性。結(jié)果表明：在乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%，料液比為1∶50，微波功率為200 W，微波時(shí)間為80 s的條件下，藜麥醇提物的提取率達(dá)10.984 mg/g（平均提取率為10.993 mg/g），優(yōu)化工藝穩(wěn)定、可靠。抑菌性試驗(yàn)表明藜麥醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，且抑菌性隨藜麥醇提物濃度增大而增強(qiáng)。

藜麥；醇提物；微波輔助；抑菌性

0 前言

藜麥Chenopodium quinoa Willd屬藜科（藜科可食用的植物比較少見(jiàn)），雙子葉植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，是印加土著居民的傳統(tǒng)食物，有7 000多年的種植歷史，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織認(rèn)為藜麥?zhǔn)俏ㄒ豢蓾M足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的單一植物，正式推薦藜麥為最適宜人類(lèi)的完美全營(yíng)養(yǎng)食品[1]。藜麥?zhǔn)且环N高蛋白、低熱量、活性物質(zhì)豐富的食物，適合不同人群食用[2]。同時(shí)，藜麥含有在大多數(shù)水果和蔬菜中含量甚微的異黃酮，可作為人類(lèi)和其他哺乳動(dòng)物的外源性化合物，適合所有人群。黃酮類(lèi)化合物具有多種生物活性，可用于抗菌、消炎、抗突變、降壓等，在抗氧化、抗癌、防癌等方面也有顯著效果[3]。前人多用醇水混合物提取不同材料中的黃酮類(lèi)化合物，在刺芹[4]、牡荊[5]、甘薯[6]、銀杏[7]、金銀花[8]、橙皮[9]、大蒜[10]等中進(jìn)行了黃酮的提取與含量測(cè)定，結(jié)果表明，各種物質(zhì)中黃酮含量及提取率均不同，大蒜中黃酮提取率最低，為1.122 mg/g，甘薯中黃酮提取率最高，為87.15 mg/g。然而，有關(guān)藜麥黃酮類(lèi)化合物的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少[11]，為開(kāi)發(fā)利用日益受到國(guó)際社會(huì)重視的藜麥資源，本試驗(yàn)對(duì)藜麥醇提物及其抑菌性進(jìn)行了初步探討，以期為藜麥黃酮類(lèi)物質(zhì)及醇提物等有效成分的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

藜麥（產(chǎn)地：山西靜樂(lè)）種子：山西省忻州市糧油站購(gòu)買(mǎi)。金黃色葡萄球菌：山西省忻州師范學(xué)院生物系實(shí)驗(yàn)室提供。WFZ UV-2102C紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；XH-MC-1實(shí)驗(yàn)室微波合成儀:上海祥鵠科技有限公司；G6R迅數(shù)菌落計(jì)數(shù)儀：杭州迅數(shù)科技有限公司；SW-CJ-1F凈化工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海云泰儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

本試驗(yàn)參照黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑5 mg，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇完全溶解后，再用此乙醇定容至50.0 mL，搖勻得到質(zhì)量濃度為0.1 g/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 6只 10 mL 比色管中，然后用60%的乙醇定容至5.0 mL，再分別從中吸取2.0 mL于6只10 mL比色管中，加入5%的亞硝酸鈉溶液 0.6 mL，搖勻，靜置 6 min后，加入 10%的硝酸鋁溶液0.6 mL，搖勻，靜置6 min后，再加入4%的氫氧化鈉溶液4.0 mL，搖勻，靜置10 min后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，每次加入試劑后，都應(yīng)充分振蕩以利于反應(yīng)完全。以蘆丁質(zhì)量濃度x（mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度值y為縱坐標(biāo)，所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=4.217 1x-0.007 19，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998 82。

1.2.2 藜麥醇提物提取率的計(jì)算

吸取樣品液2.0 mL于比色管中，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測(cè)定吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算質(zhì)量濃度（C），然后計(jì)算每克藜麥醇提物的提取率，按下式計(jì)算：提取率=（C×V×稀釋倍數(shù)）/原料質(zhì)量，其中C為藜麥醇提物的質(zhì)量濃度（mg/mL），V 為提取液體積（mL）。

1.2.3 藜麥醇提物提取方法

藜麥種子干燥至恒質(zhì)量→粉碎過(guò)30目篩→加入提取劑后微波輔助提取→離心取上清液，并量取體積→測(cè)定醇提物含量。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藜麥醇提物提取率的影響

稱取干燥的藜麥粉末0.1 g，在料液比為1∶45，微波功率為200 W，微波時(shí)間為100 s的條件下，分別以體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇微波輔助提取藜麥醇提物，提取液冷卻后3 500 r/min離心10 min，用移液槍分別小心吸取上清液0.5 mL放入10 mL具塞試管中，并用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇稀釋至2 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.6 mL，混勻，靜置6 min；再加入10%的硝酸鋁溶液0.6 mL，混勻，靜置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，靜置10 min，以 2 mL蒸餾水和所用的試劑混合做空白，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)取吸光度。

1.2.4.2 料液比對(duì)藜麥醇提物提取率的影響

稱取干燥的藜麥粉末0.1 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%，微波功率為200 W，微波時(shí)間為100 s的條件下，分別以料液比為 1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55微波輔助提取藜麥醇提物，提取及測(cè)定方法同上。

1.2.4.3 微波功率對(duì)藜麥醇提物提取率的影響

稱取干燥的藜麥粉末0.1 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%，料液比為1∶45，微波時(shí)間為100 s的條件下，分別以微波功率為 100、150、200、250、300 W微波輔助提取藜麥醇提物，提取及測(cè)定方法同上。

1.2.4.4 微波時(shí)間對(duì)藜麥醇提物提取率的影響

稱取干燥的藜麥粉末0.1 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%，料液比為1∶45，微波功率為 200 W的條件下，分別以微波時(shí)間為 80、90、100、110、120 s微波輔助提取藜麥醇提物，提取及測(cè)定方法同上。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，為了進(jìn)一步確定微波輔助提取藜麥醇提物的最佳工藝，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率、微波時(shí)間為考察因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.6 藜麥醇提物抑菌性研究

1.2.6.1 培養(yǎng)基配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基主要廣泛用于細(xì)菌的培養(yǎng)，又稱為普通培養(yǎng)基。其pH呈中性或微堿性，有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。配方為：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 15～20 g、水 1 000 mL、pH 7.4～7.6。事先按配方稱好各個(gè)藥品，在鍋中加入1 000 mL自來(lái)水煮沸，再依次加入稱好的藥品，待除了瓊脂以外的藥品都融化后，一邊加入瓊脂一邊攪拌，防止粘鍋，然后將配制好的溶液定容到1 000 mL，最后用精密pH計(jì)測(cè)量培養(yǎng)基的pH值，若培養(yǎng)基偏酸，則逐滴加入1 mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)測(cè)其pH值，直至達(dá)7.6。若培養(yǎng)基偏堿，則用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)，注意避免回調(diào)，以防影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子濃度。最后將配好的培養(yǎng)基分裝到事先備好的干凈錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中的量不要超過(guò)容積的一半，然后在瓶口塞上棉塞，在棉塞外面包上報(bào)紙，以阻止細(xì)菌進(jìn)入。

1.2.6.2 滅菌

將上述分裝好的培養(yǎng)基、500 mL蒸餾水、6支編號(hào)的10 mL具塞試管、10個(gè)培養(yǎng)皿、1個(gè)涂布器，用121.3℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.6.3 制作菌懸液

在超凈臺(tái)上，在6支試管中各倒入10 mL無(wú)菌水，然后將培養(yǎng)后的金黃色葡萄球菌的平皿取出觀察挑選單菌落，用接種針挑取適量菌體放入編號(hào)為1的無(wú)菌水中，制成菌懸液，然后用移液槍吸取200 μL菌懸液放入2號(hào)試管搖勻，再?gòu)?號(hào)吸取200 μL放入3號(hào)，依次進(jìn)行直至6號(hào)管，得充分稀釋的菌懸液。

1.2.6.4 涂布

取出8個(gè)培養(yǎng)皿，設(shè)兩次重復(fù)，分別標(biāo)號(hào)0、1、2、3，待倒入的培養(yǎng)基凝固后，在標(biāo)號(hào)為1的培養(yǎng)皿中加入100 μL提取液(按最佳提取工藝制作），2號(hào)加入 200 μL，3 號(hào)加入 300 μL，然后用涂布器涂布均勻。

用移液槍分別吸取100 μL 6號(hào)試管中的菌懸液加入上述8個(gè)培養(yǎng)皿中，并用涂布器涂布均勻，最后將涂布完成的培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)12 h。

1.2.6.5 計(jì)數(shù)菌落

用菌落計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)菌落數(shù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2003作圖，DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響（圖1）

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，藜麥醇提物提取率逐漸升高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)黃酮提取率增速最大，之后緩慢增長(zhǎng)，在體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)提取率達(dá)到最大值。因此，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%，此時(shí)的提取率為8.380 mg/g。

2.1.2 料液比對(duì)提取率的影響（圖2）

圖2 料液比對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate

由圖2可知，藜麥醇提物提取率隨料液比增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。在料液比為1∶45時(shí)提取率達(dá)到最大值，之后隨著料液比的增大提取率反而下降。提取劑量過(guò)少時(shí)，濃度差太小，藜麥醇提物成分未能充分浸出；提取劑過(guò)多時(shí)，可能溶解出更多其他成分，影響了藜麥醇提物的溶出。因此，最佳料液比為1∶45，此時(shí)提取率為8.278 mg/g。

2.1.3 微波功率對(duì)提取率的影響（圖3）

圖3 微波功率對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of microwave power on the extraction rate

由圖3可知，藜麥醇提物提取率隨微波功率的增大略有提高，在微波功率200 W時(shí)達(dá)最大值，之后提取率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)微波時(shí)間一定時(shí)，微波功率越大，系統(tǒng)升溫越快，系統(tǒng)內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)越快，越有利于藜麥醇提物的浸出；而功率過(guò)大時(shí)，系統(tǒng)劇烈沸騰，提取劑迅速揮發(fā)，并且強(qiáng)熱會(huì)破壞有效物質(zhì)，故提取率下降。因此，最佳微波功率為200 W，此時(shí)提取率為8.425 mg/g。

2.1.4 微波時(shí)間對(duì)提取率的影響（圖4）

圖4 微波時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of microwave time on the extraction rate

由圖4可知，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)提取率升高，當(dāng)時(shí)間達(dá)到90 s時(shí)提取率最高，隨后降低，達(dá)到100 s后趨于平緩。起始階段隨微波時(shí)間延長(zhǎng)分子間碰撞加劇，利于藜麥醇提物浸出，而當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)到一定程度后，分子相對(duì)運(yùn)動(dòng)減小，黃酮浸出增量不明顯，強(qiáng)熱還會(huì)破壞已浸出的藜麥醇提物。因此最佳微波時(shí)間為90 s，此時(shí)提取率為8.260 mg/g。

2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

從表2和表3可以看出，4個(gè)因素對(duì)藜麥醇提物提取率影響極顯著，大小順序依次為B(乙醇體積分?jǐn)?shù))>A(料液比)>D(微波時(shí)間)>C(微波功率)。藜麥醇提物的最佳提取工藝為A3B3C2D1，即料液比1∶50、乙醇體積分?jǐn)?shù) 100%、微波功率 200 W、微波時(shí)間80 s，提取率為10.984 mg/g。按最佳工藝提取藜麥醇提物，平均提取率為10.993 mg/g，優(yōu)于正交試驗(yàn)及單因素試驗(yàn)的結(jié)果，因此可確認(rèn)該工藝最優(yōu)。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment design and results

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments

2.3 藜麥醇提物抑菌性測(cè)定結(jié)果

為研究藜麥醇提物的抑菌性，使用菌落計(jì)數(shù)儀測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5—圖8。

由圖5至圖8可知：藜麥醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌性，且抑菌效果隨提取液量的不同而不同。抑菌性整體隨所加提取液量的增加而增強(qiáng)，金黃色葡萄球菌出現(xiàn)的范圍和頻率逐漸減少。

為進(jìn)一步明確藜麥醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌性，對(duì)菌落計(jì)數(shù)儀獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析（見(jiàn)表4、表5），結(jié)果表明藜麥醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果極顯著，但試驗(yàn)組間的抑菌性差異隨所加提取液量的增加而相對(duì)減小，對(duì)照組和試驗(yàn)組間抑菌性的差異總體隨醇提液量的增加而越顯著。

圖5 未添加提取液的菌落數(shù)Fig.5 Colony count of suspension without extracts

圖6 添加100 μL提取液的菌落數(shù)Fig.6 Colony count of suspension with 100 μL extract

圖7 添加200 μL提取液的菌落數(shù)Fig.7 Colony count of suspension with 200 μL extract

圖8 添加300 μL提取液的菌落數(shù)Fig.8 Colony count of suspension with 300 μL extract

表4 藜麥醇提物抑菌性測(cè)定結(jié)果Table 4 Antibacterial activity against Staphyloccocus aureus of the ethanol extracts

表5 藜麥醇提物抑菌性測(cè)定結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of antibacterial activity against Staphyloccocus aureus of the ethanol extracts

3 討論

藜麥?zhǔn)墙跬昝赖氖澄?，有極大的食用和藥用價(jià)值，本課題對(duì)藜麥醇提物的提取工藝進(jìn)行了考察，結(jié)果表明藜麥醇提物的最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)100%，料液比1∶50，微波功率200 W，微波時(shí)間 80 s，提取率為10.984 mg/g。按此最佳提取工藝進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，得到藜麥醇提物平均提取率為10.993 mg/g。表明此提取工藝比較穩(wěn)定、可靠，有較強(qiáng)可借鑒性。前人研究表明，超聲波輔助提取藜麥總黃酮提取率可達(dá)3.737 mg/g[12]，比較而言，本研究藜麥醇提物（主要成分為黃酮）的提取率更高，且提取時(shí)間更短，所需溫度更低，自然降低了能耗，不僅環(huán)保而且降低了提取成本。原因是微波是電磁波，具有加熱速度快(不需熱傳導(dǎo)過(guò)程，內(nèi)外同時(shí)加熱）、加熱均勻、選擇性加熱的特點(diǎn)，能在對(duì)藜麥醇提物破壞力盡可能低的情況下，高效率輔助乙醇提?。欢暡ㄊ锹暡?，能使液體微粒之間發(fā)生猛烈撞擊，從而使液體溫度驟然升高，加速化學(xué)反應(yīng)，可能因?yàn)橐鸱磻?yīng)的過(guò)程比較緩慢和復(fù)雜，提取過(guò)程中一些黃酮類(lèi)物質(zhì)被破壞，所以造成提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率不高。本試驗(yàn)還對(duì)藜麥醇提物進(jìn)行了抑菌性的測(cè)定，結(jié)果表明藜麥醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌有顯著的抑菌作用。不足之處是：本試驗(yàn)提取的為藜麥醇提物的粗提物，沒(méi)有進(jìn)一步分離純化，未測(cè)定藜麥醇提物對(duì)供試菌的最低抑菌濃度（MIC）。需要進(jìn)一步研究藜麥醇提物的具體有效成分及其抗氧化性，并探討其抗氧化性最佳的環(huán)境條件，如溫度、pH、光照（時(shí)間、強(qiáng)度、種類(lèi)）等，為藜麥的開(kāi)發(fā)利用提供參考。目前，作為一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的安全農(nóng)產(chǎn)品，藜麥因含具有抗氧化性的黃酮類(lèi)物質(zhì)，其應(yīng)用范圍將越來(lái)越廣泛，可以添加到護(hù)膚品、食品、保健品等中，既能保證效果，又綠色環(huán)保。

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ORTHOGONAL OPTIMIZATION OF EXTRACTION PROCESS OF THE ETHANOL EXTRACTS OF CHENOPODIUM QUINOA WILLD AND ITS ANTIBACTERIAL ACTIVITY

XU Lan，CAO Wei
（Department of Biology， Xinzhou Teachers University， Xinzhou 034000， China）

In order to provide references for development and utilization of Chenopodium quinoa，we optimized the microwave-assisted extraction process of ethanol extracts of Chenopodium quinoa，and discussed the antibacterial activity of the extract.Results showed that the extraction rate of the ethanol extracts reached 10.984 mg·g-1(average extraction rate 10.993 mg·g-1)under the optimum conditions of ethanol volume fraction 100%，solid-to-liquid ratio 1 ∶50，microwave power 200 W，and microwave time 80 s.The process was stable and reliable.Antibacterial tests showed that the ethanol extracts of Chenopodium quinoa had significant effect in inhibiting Staphylococus aureus，and the antibacterial activity was enhanced with the concentration of the ethanol extract.

Chenopodium quinoa；ethanol extracts；microwave assisted；antibacterial activity

TS201.1

B

2016-11-25

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201503124）；山西省高等學(xué)校教學(xué)改革創(chuàng)新項(xiàng)目（J2016096）；忻州師范學(xué)院博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目（2016）

徐瀾（1975—），女，山西偏關(guān)人，副教授，博士，主要從事植物生理生化教學(xué)與研究工作。

1673-2383(2017)03-0083-06

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-6-21 10:51:03