富含谷氨酸釀酒酵母的篩選及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

劉立聰，胡依雯，王志，代俊，李欣，姚娟，鄭國(guó)斌，呂正波，陳雄*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068；2.安琪酵母股份有限公司湖北省酵母功能重點(diǎn)試驗(yàn)室，湖北宜昌443003，3.安琪酵母（德宏）有限公司，云南德宏678400）

富含谷氨酸釀酒酵母的篩選及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

劉立聰1，胡依雯1，王志1，代俊1，李欣1，姚娟2，鄭國(guó)斌2，呂正波3，陳雄1*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068；2.安琪酵母股份有限公司湖北省酵母功能重點(diǎn)試驗(yàn)室，湖北宜昌443003，3.安琪酵母（德宏）有限公司，云南德宏678400）

從農(nóng)家自釀葡萄酒中篩選出一株富含谷氨酸釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）F-5，其26S rDNA核苷酸序列與S.cerevisiaeTY12的26S rDNA核苷酸序列同源性為100%。以胞內(nèi)谷氨酸含量為目標(biāo)，采用響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，建立糖蜜、工業(yè)蛋白胨和KH2PO4的二次回歸模型，確定培養(yǎng)基最佳配方為：糖蜜（含30%蔗糖）100 mL/L、酵母浸粉10 g/L、工業(yè)蛋白胨20 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、FeSO4·7H2O 2 g/L。在此優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)24 h，胞內(nèi)游離谷氨酸達(dá)到了3.29%，比優(yōu)化前提高了87.8%。

釀酒酵母；胞內(nèi)游離谷氨酸；發(fā)酵培養(yǎng)基；響應(yīng)面法

隨著生活水平的提高，營(yíng)養(yǎng)功能單一的味精作為第一代增鮮調(diào)味品，與人們對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味的高層次需求存在差距。因此，作為加強(qiáng)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性調(diào)整的新型調(diào)味品——酵母抽提物應(yīng)運(yùn)而生[1-2]。酵母抽提物作為一種正在快速發(fā)展的調(diào)味品，其研制與應(yīng)用已經(jīng)越來(lái)越受到人們關(guān)注[3-4]；酵母抽提物是通過(guò)發(fā)酵工程技術(shù)高效率獲得釀酒酵母細(xì)胞，并將胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等進(jìn)行降解后精制而成的天然調(diào)味料。主要成分為多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B族維生素及微量元素，相比于味精具有純天然、營(yíng)養(yǎng)豐富、味道醇厚等諸多優(yōu)點(diǎn)[5]。

釀酒酵母是生產(chǎn)酵母抽提物的主要原料，含有18種以上氨基酸的酵母抽提物，雖然總體呈味比味精強(qiáng)，但是存在鮮度不突出的缺點(diǎn)[6-7]，而酵母抽提物中谷氨酸的含量不足是其主要原因。因此開(kāi)展富谷氨酸釀酒酵母菌種選育、發(fā)酵優(yōu)化等方面的研究工作對(duì)生產(chǎn)高質(zhì)量酵母抽提物具有重要意義和廣闊的市場(chǎng)前景及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[8-9]。

本研究從農(nóng)家自釀葡萄酒中分離純化富含谷氨酸酵母菌株，通過(guò)26SrDNA序列分析確定為釀酒酵母，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化了其發(fā)酵培養(yǎng)基，以期提高胞內(nèi)游離谷氨酸含量，為滿(mǎn)足人們對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味的高層次需求奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒：湖北農(nóng)村家釀葡萄酒。

篩選培養(yǎng)基（孟加拉紅培養(yǎng)基[10-11]）：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20 g，1/3000孟加拉紅溶液100 mL，氯霉素0.1 g，水1000 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

斜面培養(yǎng)基：蔗糖50g/L，酵母浸粉20g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO41 g/L，pH 4.8～5.0，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：蔗糖100g/L，酵母浸粉20g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO41g/L，pH4.8～5.0，250mL三角瓶裝液量50mL，121℃滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：同種子培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-75S11立式壓力蒸汽滅菌器：海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-S22水浴鍋：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；TG18M臺(tái)式高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；HNY-211B全溫振蕩培養(yǎng)箱：天津歐諾儀器儀表有限公司；DZF-6020電熱鼓風(fēng)干燥箱：重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱、SX2-5-12高溫箱形電爐：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；BS110S電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；U3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國(guó)安捷倫公司；5417R型冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；ZYUPH-I-10T純水儀：Millipore；DYY-7B電泳儀：北京六一儀器廠；DRC-100H/DLX-254A紫外凝膠成像系統(tǒng)：Gene公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

農(nóng)家自釀葡萄酒搖勻，吸取5mL葡萄酒原液，接種到裝量50mL種子培養(yǎng)基的搖瓶中，恒溫?fù)u床中30℃、180 r/min培養(yǎng)12 h備用。

1.3.2 菌種的分離純化

吸取1 mL備用樣品加入裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，充分振蕩使菌體混勻，無(wú)菌條件下采用10倍梯度稀釋法將上清制成10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液，分別取0.50 mL加入平皿中（篩選培養(yǎng)基，裝液量約20 mL），用涂布棒涂布均勻，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h[12]。平皿中長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行鏡檢，對(duì)符合酵母菌特征的單菌落劃線，接種到新鮮的篩選培養(yǎng)基平皿中，30℃培養(yǎng)48 h后，采用平板劃線操作，獲取單菌落。重復(fù)以上操作，直到獲得純的菌株，并斜面保存。

1.3.3 富谷氨酸酵母菌株的篩選

將斜面菌種用接種環(huán)勾出一環(huán)在新鮮試管斜面上劃滿(mǎn)整個(gè)表面，30℃培養(yǎng)12 h，后無(wú)菌操作向每支新鮮斜面試管中倒入15 mL無(wú)菌水，洗脫表面菌體，并用移液槍吹打均勻成菌懸液，然后用移液槍轉(zhuǎn)接至250 mL三角瓶，每瓶接種量為10%（5 mL菌懸液），30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)10 h。然后轉(zhuǎn)接到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，每瓶接種量10%（5 mL），30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)18 h后取樣，樣品水洗2次后加2倍體積的去離子水重懸菌體，-20℃冷凍1 h后，80℃水浴20 min，反復(fù)凍融3次，離心取上清，用高效液相色譜檢測(cè)上清中的谷氨酸濃度，濃度高的菌株保留，反之淘汰。

1.3.4 酵母胞內(nèi)谷氨酸測(cè)定

樣品預(yù)處理：取發(fā)酵培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵液2.5 mL，6 500 r/min離心5 min倒掉上清，水洗菌體2次，再用5 mL去離子水重懸菌體，-20℃凍1 h，后80℃水浴15 min，反復(fù)凍融3次[13]。凍融好的菌懸液6 500 r/min離心5 min，取上清600 μL于2 mL離心管，再向其中加入2倍體積（1.2 mL）冰凍后的無(wú)水乙醇，10 000 r/min、4℃離心5 min，0.22 μm過(guò)濾上清得到檢測(cè)樣，-20℃條件下保存。胞內(nèi)游離谷氨酸含量采用HPLC檢測(cè)[14]。

HPLC分析條件：色譜柱為安捷倫ZORBAX SB-Aq column（150 mm×4.6 mm×5 μm）；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；采用10 mol/L pH 1.8的K2HPO4（磷酸調(diào)pH）作為流動(dòng)相；流速0.6 mL/min。根據(jù)所測(cè)標(biāo)品，谷氨酸的保留時(shí)間為4.6 min。

1.3.5 26S rDNA基因序列分析

提取酵母菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），對(duì)獲得的總基因組DNA進(jìn)行26S rDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，采用引物：IST1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，IST4：5′-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3′，擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃、5 min；變性94℃、30 s；退火60℃、30 s；延伸72℃、1 min；30個(gè)循環(huán)；72℃、10 min。將PCR擴(kuò)增片段回收，送至武漢鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，繪制進(jìn)化樹(shù)，確定菌株在系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)上的歸屬。

1.3.6 培養(yǎng)基優(yōu)化

以胞內(nèi)谷氨酸量為指標(biāo)通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定最適碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的濃度，用Design Expert 8.0.6軟件2水平確定谷氨酸合成影響顯著因子，再通過(guò)爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)顯著因子水平進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

通過(guò)篩選、純化、菌落形態(tài)、顯微鏡觀察（出芽生殖特點(diǎn)）以及菌株生長(zhǎng)周期和產(chǎn)胞內(nèi)游離谷氨酸的測(cè)定，從300余株菌株中獲得6株生長(zhǎng)快、產(chǎn)胞內(nèi)游離谷氨酸能力較強(qiáng)的酵母菌株（編號(hào)為F-5、A-3、F-4、B-15、E-11、A-12），其在搖瓶水平（種子培養(yǎng)基）發(fā)酵過(guò)程谷氨酸合成特點(diǎn)如圖1所示。

圖1 酵母菌胞內(nèi)谷氨酸周期變化Fig.1 Periodic changes of intracellular glutamate content synthesized by yeast

由圖1可知，F(xiàn)-5和A-3菌株的胞內(nèi)谷氨酸合成性能明顯要優(yōu)于其他4株菌，其峰值濃度分別達(dá)到了1.75%和1.67%，顯著高于其他菌株。雖然24 h后F-5和A-3的谷氨酸都呈下降趨勢(shì)，但F-5菌株的下降趨勢(shì)明顯小于A-3菌株，因此，后續(xù)試驗(yàn)選用F-5菌株作為試驗(yàn)菌株。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌株F-5 26S rDNA基因片段PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖

提取酵母菌基因組DNA，對(duì)獲得的總基因組DNA進(jìn)行26S rDNA的PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 菌株F-5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR electropherogram of amplified product of strain F-5

由圖2可以看出，26S rDNA基因大小約為625 bp。

2.2.2 菌株F-5 26S rDNA基因序列

菌株F-5 26S rDNA基因測(cè)序結(jié)果如下：

2.2.3 菌株F-5的26S rDNA基因發(fā)育樹(shù)

菌株F-5的26SrDNA核苷酸序列通過(guò)BLAST軟件比對(duì)后，結(jié)果顯示，其與釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）TY12的26S rDNA的核苷酸序列同源性為100%。用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3），表明菌株F-5屬于酵母屬（Saccharomyces）的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖3 菌株F-5基于26S rDNA基因序列發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain F-5 based on 26S rDNA gene sequence

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.3.1 Plackett-Burman試驗(yàn)[15]

按照Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，把每個(gè)因素設(shè)計(jì)成高（+1）、低（-1）2個(gè)水平，高水平為低水平的2倍，胞內(nèi)谷氨酸含量為響應(yīng)值，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，各因素及顯著性分析見(jiàn)表2。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

表2 各因素水平、效應(yīng)值及顯著性分析結(jié)果Table 2 Results of level of each factor,effect value and significant analysis

由表2可知，糖蜜、酵母浸粉、KH2PO4表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，蛋白胨、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O表現(xiàn)為正效應(yīng)?？尚哦龋?5%的因素為糖蜜，表現(xiàn)為極顯著。其中工業(yè)蛋白胨和磷酸二氫鉀可信度＞90%，且貢獻(xiàn)值排在前三位。因此確定糖蜜、工業(yè)蛋白胨、KH2PO4為主要影響因素進(jìn)行下一步試驗(yàn)。FeSO4·7H2O影響不顯著，后續(xù)試驗(yàn)將其含量降低為2.0g/L。

2.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)找出的顯著影響因素及效應(yīng)值，設(shè)計(jì)合適的步長(zhǎng)進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，尋找最大產(chǎn)量區(qū)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of the steepest ascent experiments

由表3可知，胞內(nèi)谷氨酸含量最高在第4組，因此以第4組的水平作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，即糖蜜為120 mL/L、工業(yè)蛋白胨為16 g/L、KH2PO4為0.7 g/L。

2.3.3 響應(yīng)面分析的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的中心點(diǎn)，用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將最陡爬坡試驗(yàn)中的因素分別標(biāo)記為X1、X2、X3，以發(fā)酵培養(yǎng)24 h后收集菌體所測(cè)胞內(nèi)谷氨酸含量為響應(yīng)值，標(biāo)記為Y，中心組合試驗(yàn)因素變量及水平見(jiàn)表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6。

表4 中心組合試驗(yàn)因素與水平Table 4 Factors and levels of center composite experiments

表5中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)及結(jié)果通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件響應(yīng)面分析程序進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得3種顯著影響因子與胞內(nèi)谷氨酸含量的二次多項(xiàng)式回歸模型方程：Y=2.75-0.067X1-6.024×10-3X2-0.013X3-0.040X1X2+ 0.033X1X3+2.500×10-3X2X3+0.16X12+0.13X22+0.10X32

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of center composite experiments

由表6可知，模型大于F值的概率P＜0.01，表明模型非常顯著，對(duì)響應(yīng)值Y影響也非常顯著，可信度較高；模型的二次項(xiàng)X12、X22、X32對(duì)胞內(nèi)谷氨酸含量的影響非常顯著（P＜0.01），模型失擬項(xiàng)（Lack of Fit）的P值為0.387 5，表明模型選擇合適，可以用此模型對(duì)釀酒酵母產(chǎn)胞內(nèi)谷氨酸的量進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。

表6 回歸方程方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

2.3.4 最佳濃度的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)上述回歸方程繪出響應(yīng)面分析圖，以確定3個(gè)因素對(duì)胞內(nèi)谷氨酸含量的影響，響應(yīng)面圖見(jiàn)圖4。由圖4可知，響應(yīng)面分析圖的曲面開(kāi)口向下，說(shuō)明二次項(xiàng)回歸方程存在最大值。由Design Expert8.0.6軟件分析得到最適培養(yǎng)基中糖蜜、工業(yè)蛋白胨、磷酸二氫鉀所對(duì)應(yīng)的實(shí)際值分別為100mL/L、20 g/L、0.5 g/L。即最適培養(yǎng)基組成為：糖蜜100 mL/L、酵母浸粉10 g/L、工業(yè)蛋白胨20 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、FeSO4·7H2O 2 g/L。將該組合帶入上述二次多項(xiàng)式回歸模型方程，預(yù)計(jì)釀酒酵母胞內(nèi)谷氨酸含量達(dá)3.289%。利用上述最適培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶驗(yàn)證試驗(yàn)，釀酒酵母搖瓶發(fā)酵24 h后取樣檢測(cè)胞內(nèi)谷氨酸含量達(dá)到3.29%，比優(yōu)化前發(fā)酵配方（1.75%）提高了87.8%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合。

圖4 糖蜜、工業(yè)蛋白胨和KH2PO4交互作用對(duì)胞內(nèi)谷氨酸含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between molasses,industrial peptone and KH2PO4on intracellular glutamate contents

3 結(jié)論

從家釀葡萄酒中分離得到一株富谷氨酸釀酒酵母菌株F-5，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基上，胞內(nèi)谷氨酸含量最高達(dá)到1.75%?？紤]到工業(yè)生產(chǎn)以糖蜜作為主要碳源，因此確定在以糖蜜作為主要碳源的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化菌株J-5最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：糖蜜（含30%蔗糖）100 mL/L、酵母浸粉10g/L、工業(yè)蛋白胨20 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、FeSO4·7H2O 2 g/L。在此優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵，胞內(nèi)游離谷氨酸達(dá)到了3.29%，比優(yōu)化前提高了87.8%。為生產(chǎn)高品質(zhì)酵母抽提物奠定了基礎(chǔ)。

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Screening ofSaccharomyces cerevisiaewith high glutamic acid content and optimization of fermentation medium

LIU Licong1,HU Yiwen1,WANG Zhi1,DAI Jun1,LI Xin1,YAO Juan2,ZHENG Guobin2,LV Zhengbo3,CHEN Xiong1*
(1.Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Key Laboratory Fermentation Engineering(Ministry of Education),College of Food and Bioengineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China;2.Hubei Province Key Laboratory of Yeast Function,Angel Yeast Co.,Ltd.,Yichang 443003,China;3.Angel Yeast(De Hong)Co.,Ltd.,Dehong 678400,China)

ASaccharomyces cerevisiaeF-5 with high glutamic acid content was screened from home-made wine.The homology of its 26S rDNA sequence with the 26S rDNA sequence ofS.cerevisiaeTY12 was 100%.Using the intracellular glutamate content as evaluation indexes,the fermentation medium of the strain F-5 was optimized by response surface methodology,and quadratic regression model of molasses,industrial peptone and KH2PO4was established.The optimum formula of fermentation medium were determined as follows:molasses(30%sucrose)100 ml/L,yeast extract powder 10 g/L,industrial peptone 20 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L,K2HPO40.5 g/L,and FeSO4·7H2O 2 g/L.The content of intracellular free glutamate was up to 3.29%under the optimum medium at 24 h,which was 87.8%higher than that of before optimization.

Saccharomyces cerevisiae;intracellular free glutamate;fermentation medium;response surface methodology

Q815

0254-5071（2017）06-0116-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.024

2017-02-17

劉立聰（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：陳雄（1969-），男，教授，博士，研究方向?yàn)獒勗旃こ獭?/p>