100%大麥啤酒釀造過程中老化Strecker醛的研究

朱明光，王敏*

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

100%大麥啤酒釀造過程中老化Strecker醛的研究

朱明光，王敏*

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

分別采用上面發(fā)酵工藝與下面發(fā)酵工藝進(jìn)行100%大麥啤酒及100%麥芽啤酒的釀制，并對其麥汁的氨基酸含量、老化Strecker醛、自由基以及新鮮啤酒中老化Strecker醛的含量等進(jìn)行了對比分析。研究發(fā)現(xiàn)，就麥汁而言，100%大麥麥汁中老化Strecker醛的含量都明顯低于100%麥芽麥汁；同樣的麥汁，上面發(fā)酵方式還原Strecker醛的能力明顯優(yōu)于下面發(fā)酵方式。就啤酒而言，經(jīng)酵母還原后，新鮮啤酒中的老化Strecker醛含量較麥汁含量低，且100%大麥啤酒中老化Strecker醛的含量低于100%麥芽啤酒中的含量。100%麥芽麥汁的自由基含量是100%大麥麥汁的近3倍。這都預(yù)示著100%大麥啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性（新鮮度）明顯好于100%麥芽啤酒。

100%大麥釀酒；Strecker醛；自由基；氨基酸

啤酒經(jīng)過一段時(shí)間的貯存后會(huì)產(chǎn)生老化味，主要是貯存時(shí)形成了揮發(fā)性的羰基化合物，Strecker醛是啤酒老化風(fēng)味的重要成分[1]，啤酒老化Strecker醛包括2-甲基-丙醛、3-甲基-丁醛、2-甲基-丁醛、甲硫基丙醛和苯乙醛。貯存期間產(chǎn)生的Strecker醛僅占啤酒中總Strecker醛的15%，85%的Strecker醛來自麥汁制備[2]，所以優(yōu)化釀酒工藝是減少啤酒中Strecker醛最有效的方法。許多啤酒老化物的前體來自制麥過程，直接使用大麥替代大麥芽釀酒無需經(jīng)過制麥工藝，可以減少啤酒中老化物質(zhì)的含量而且對大麥的品質(zhì)要求不高，可降低啤酒的生產(chǎn)成本，節(jié)能減排[3-4]。

當(dāng)前對100%大麥釀酒的研究，都還是使用傳統(tǒng)的下面發(fā)酵工藝[5-6]，還沒有使用上面發(fā)酵工藝的報(bào)導(dǎo)。上面發(fā)酵啤酒利用上面啤酒酵母，采用上面發(fā)酵工藝釀制，具有接種溫度高，發(fā)酵溫度高，發(fā)酵快，風(fēng)味獨(dú)特等特點(diǎn)[7]。由于縮短了周期，提高了經(jīng)濟(jì)效益，有利于擴(kuò)大生產(chǎn)。

該實(shí)驗(yàn)通過對比研究100%大麥麥汁和100%麥芽麥汁的氨基酸含量，采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（solid phase microextraction-gaschromatography-mass spectrometry，SPMEGC-MS）檢測麥汁和新鮮啤酒中的老化醛含量，并分析自由基含量，以及不同發(fā)酵方式對老化Strecker醛的影響，以期為提高啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性和優(yōu)化釀酒工藝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

進(jìn)口Schooner品種麥芽、進(jìn)口Schooner品種大麥：澳大利亞；諾維信OndeaProR酶：諾維信中國生物技術(shù)有限公司；氨基酸衍生試劑-AQC：美國Waters公司；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、苯乙醛和糠醛）、苯基叔丁基硝酮（α-phenyl-t-butyl nitrone，PBN）（光譜純）：美國Sigma公司；乙醇（色譜純）：德國Merck公司；超純水（≥18.2 MΩ）：實(shí)驗(yàn)室自制。

上面發(fā)酵菌株W303-1A：德國慕尼黑Doemens啤酒學(xué)院；下面發(fā)酵菌株CGMCC2.412：中國科學(xué)院普通微生物保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q plus純水儀：德國Millipore公司；固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）自動(dòng)進(jìn)樣器：瑞士CTC公司；65μmPDMS-DVB、65μmDVB/Carboxen/PDMS固相微萃取纖維頭：美國Supelco公司；Clarus600氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）儀：美國PerkinElmer公司；DB-5MS色譜柱（60m×250μm×0.25μm）：美國Agilent公司；ESR電子自旋共振儀：德國Bruker公司；Waters e2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Waters公司；SKALAR全自動(dòng)流動(dòng)分析儀：荷蘭SKALAR公司。

1.3 方法

100%麥芽麥汁：定型冷麥汁濃度10°P，試驗(yàn)2個(gè)發(fā)酵罐，1罐上面發(fā)酵，1罐下面發(fā)酵。

100%大麥麥汁：定型冷麥汁濃度10°P，試驗(yàn)2個(gè)發(fā)酵罐，1罐上面發(fā)酵，1罐下面發(fā)酵。

1.3.1 100%麥芽麥汁的制備

糖化鍋43℃下料→43℃、25min→50℃、55min→65℃、65 min→78℃過濾

使用對輥粉碎機(jī)粉碎麥芽，麥芽下料溫度43℃，下料結(jié)束，43℃保溫25 min，升溫至50℃進(jìn)行蛋白休止55 min，之后并醪升溫至65℃，65℃保溫65 min糖化，碘檢合格后升溫至78℃，進(jìn)行過濾。

1.3.2 100%大麥麥汁的制備

糖化鍋50℃下料→50℃、30min→54℃、45min→64℃、65 min→78℃、25 min→78℃過濾

使用六輥粉碎機(jī)粉碎大麥；大麥50℃下料，持續(xù)攪拌，調(diào)整醪液pH值為5.6～5.8，添加諾維信Ondea ProR酶2 kg/t大麥，下料結(jié)束，在50℃條件下保溫30 min，之后升溫至54℃并保溫45 min，接著升溫至64℃糖化65 min，然后升溫至78℃，保溫25 min后過濾。

1.3.3 上面發(fā)酵法工藝

麥汁冷卻至16℃，添加經(jīng)擴(kuò)培的上面發(fā)酵酵母W303-1A，接種量為擴(kuò)培液體積與麥汁體積的比例為1∶10。

發(fā)酵工藝：16℃發(fā)酵，約2 d降糖至4.0°P左右，封罐。封罐后每天檢測雙乙酰含量，直降至0.05 mg/L以下，開始降溫，降至冷貯溫度。冷貯結(jié)束，后貯酒過濾。

1.3.4 下面發(fā)酵法工藝

麥汁冷卻至10℃，添加經(jīng)擴(kuò)培的下面酵母CGMCC 2.412，接種量為擴(kuò)培液體積與麥汁體積的比例為1∶10。

滿罐溫度10℃，主酵溫度10℃，當(dāng)糖度降至6.0°P時(shí)，主酵結(jié)束，開始升溫至12℃進(jìn)行雙乙酰還原，當(dāng)糖度降至

4.0 °P時(shí)，封罐，當(dāng)雙乙酰含量降至0.05 mg/L以下，開始降溫，直接降至冷貯溫度。冷貯結(jié)束，后貯酒過濾。

1.3.5 麥汁α-氨基酸態(tài)氮的檢測[8]

使用SKALAR全自動(dòng)流動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測。

1.3.6 麥汁總氮的測定[9]

麥汁總氮含量的測定參考輕工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T1686—2008《啤酒麥芽》。

1.3.7 麥汁氨基酸含量的分析[8]

采用Waters系統(tǒng)的HPLC進(jìn)行分析。采用Waters開發(fā)的柱前衍生AccQ·Tag方法進(jìn)行測定，在衍生的同時(shí)增強(qiáng)氨基酸的極性來增強(qiáng)分離效果。AccQ·Tag方法的基礎(chǔ)在于專為氨基酸分析而開發(fā)的衍生試劑-AQC（6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯）。

1.3.8 固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定老化醛含量[10-12]

采用SPME-GC-MS柱上衍生技術(shù)。具體步驟如下：

①待測樣品處理：啤酒排氣，麥汁過濾。在20 mL頂空瓶中加入2 g NaCl。

②取5 mL樣品到20 mL頂空瓶，添加50 μL內(nèi)標(biāo)物質(zhì)對氟苯甲醛（原液稀釋105倍），旋緊瓶口。

③將65 μm PDMS-DVB固相微萃取纖維插入裝有10 mL、60 mg/L鄰-（2,3,4,5,6-五氟芐基）羥胺（O-（2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl）hydroxylamine，PFBOA）的頂空瓶中，以頂空方式50℃衍生15 min。

④將萃取纖維再放入待測樣品頂空瓶中，以頂空方式50℃萃取待測物質(zhì)45 min。

⑤上機(jī)檢測。

GC條件：色譜柱DB-5 ms（60 m×320 μm×0.25 μm）。載氣為氦氣，流速1 mL/min。進(jìn)樣口溫度250℃。無分流進(jìn)樣。程序升溫：40℃保溫2 min；以10℃/min升至140℃；以7℃/min升至250℃；250℃保溫3 min。

MS條件：電子電離（electron ionization，EI）離子源，電子能70 eV；GC-MS接口溫度：250℃；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；掃描范圍：50～550 amu。

羰基化合物的PFBOA衍生物的定性采用質(zhì)譜全掃描方式，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定性、定量選擇離子（61、181m/z）掃描方式。

⑥采用外標(biāo)系列曲線定量。

1.3.9 電子自旋共振儀檢測自由基[13-15]

采用德國Bruker公司的電子自旋共振儀（electron spin resonance，ESR）進(jìn)行測定，測定方法：

（1）ESR操作條件：

中心磁場3458 G；掃描寬度17 G；時(shí)間常數(shù)5.12；數(shù)據(jù)采集次數(shù)8次；微波功率2.36 MW；微波頻率86 kHz；調(diào)制幅度2.0 G；放大倍數(shù)2.0×103，數(shù)據(jù)處理方式S擬合。

（2）樣品處理：

樣品經(jīng)離心或過濾脫氣，吸取9.6 mL入棕色瓶中，加入0.4 mL PBN溶劑，渦旋混勻，放在60℃加熱池中機(jī)械溫浴。儀器會(huì)自動(dòng)捕獲到每個(gè)時(shí)間段的自由基強(qiáng)度，并進(jìn)行S擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥汁成分分析

利用HPLC法分別對100%大麥麥汁和100%麥芽麥汁的氨基酸含量進(jìn)行了分析，并對與氨基酸相關(guān)的總氮、α-氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)行了測定，相關(guān)數(shù)據(jù)分別見表1、表2。

表1 麥汁的理化指標(biāo)Table 1 Physiochemical indicators of the wort

表2 麥汁中氨基酸含量分析Table 2 Amino acids contents analysis in different wort

由表1可知，100%大麥麥汁的總氮和α-氨基酸態(tài)氮含量都比100%麥芽麥汁的低。從表2氨基酸含量分析中可以看出，100%大麥麥汁中A組快速吸收氨基酸、B組中速吸收氨基酸和C組慢速吸收氨基酸，所占氨基酸總量的比例分別為35%、28%和25%；而100%麥芽麥汁中A組、B組和C組所占氨基酸總量的比例分別為30%、25%和23%。不難看出，100%大麥麥汁與100%麥芽麥汁比較，A組+B組所占比例增加了8%，A組+B組+C組所占比例增加了10%；所以盡管大麥麥汁的α-氨基酸態(tài)氮含量約為140 mg/L，較麥芽麥汁中的含量163 mg/L低，但大麥麥汁中可被酵母吸收利用的氨基酸所占的比例較高，因此，能夠滿足酵母生長、發(fā)酵對氨基酸的需求[3]。

麥汁中的氨基酸含量能夠滿足酵母生長繁殖和發(fā)酵過程的需要即可，含量過高則可能會(huì)通過Strecker降解，生成相應(yīng)的Strecker醛。Strecker降解是發(fā)生在氨基酸和α-二羰基化合物之間的反應(yīng)。反應(yīng)過程是：先發(fā)生轉(zhuǎn)胺作用，然后形成的α-酮酸發(fā)生脫羧，從而形成比對應(yīng)氨基酸少一個(gè)碳原子的醛類。

由表3可知，5種啤酒老化Strecker醛（2-甲基-丙醛，3-甲基-丁醛，2-甲基-丁醛，甲硫基丙醛，苯乙醛）及與其相對應(yīng)的5種氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸）在100%大麥麥汁和100%麥芽麥汁中的含量。其中纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和蛋氨酸屬于B組中速吸收氨基酸；苯丙氨酸屬于C組慢速吸收氨基酸。結(jié)果表明，這5種氨基酸在100%大麥麥汁中的含量都低于100%麥芽麥汁中的含量。

表3 Strecker醛及對應(yīng)的氨基酸的含量Table 3 The contents of strecker aldehyde and corresponding amino acid

2.2 麥汁及新鮮啤酒中老化醛含量的分析

分別對100%大麥麥汁和100%麥芽麥汁中老化醛（5種Strecker醛和糠醛）的含量進(jìn)行了分析，相關(guān)數(shù)據(jù)分別見表4、表5；對100%大麥麥汁和100%麥芽麥汁分別采用上面發(fā)酵方式和下面發(fā)酵方式釀制成的啤酒中的老化醛也進(jìn)行了分析，相關(guān)數(shù)據(jù)見表6。

表4 Strecker醛在不同麥汁中的含量Table 4 Strecker aldehyde contents in different wort

由表4可知，這5種啤酒老化Strecker醛的含量，都是100%麥芽麥汁明顯高于100%大麥麥汁，這可能主要是由于100%大麥麥汁中α-氨基酸態(tài)氮以及5種啤酒老化Strecker醛所分別對應(yīng)的5種氨基酸的含量都較100%麥芽麥汁中的低，而且大麥不像麥芽在制麥過程中已經(jīng)經(jīng)受了高溫?zé)嶝?fù)荷，促進(jìn)了啤酒老化物質(zhì)Strecker醛的生成。

表5 糠醛在不同麥汁中的含量Table 5 Furfural contents in different wort

糠醛作為啤酒老化物質(zhì)之一，是反應(yīng)熱負(fù)荷的指示指標(biāo)之一，是制麥焙焦階段和麥汁煮沸階段的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。由表5可知，糠醛在100%麥芽麥汁中的含量明顯高于100%大麥麥汁，前者含量是后者的近2倍。這表明100%大麥麥汁經(jīng)受的熱負(fù)荷明顯低于100%麥芽麥汁。100%大麥麥汁中的啤酒老化物質(zhì)之一的糠醛含量也明顯比100%麥芽麥汁的低，5種啤酒老化Strecker醛的生成量也明顯的低于100%麥芽麥汁，預(yù)示著100%大麥啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性要優(yōu)于100%麥芽啤酒。

表6 Strecker醛在不同麥汁釀造的新鮮啤酒中的含量Table 6 Strecker aldehyde contents in differents fresh beer

麥汁中含有的啤酒老化物質(zhì)Strecker醛類和糠醛只能靠發(fā)酵過程中的酵母來還原成醇，還原的程度，主要取決于酵母的活性及酵母的還原能力。由表6可知，經(jīng)過發(fā)酵過程中的酵母還原后，5種老化醛的含量較麥汁中的含量水平下降非常明顯?？傮w來說，同樣的麥汁，上面發(fā)酵方式還原Strecker醛的能力明顯優(yōu)于下面發(fā)酵方式。100%大麥麥汁釀造出的啤酒中老化醛的含量都比100%麥芽麥汁釀造出的啤酒中的含量低，其中在兩種發(fā)酵方式釀造的大麥啤酒中，均無2-甲基丁醛，可能是由于其在100%大麥麥汁中的含量低于酵母對其完全還原的下限水平。除了跟酵母的還原能力、發(fā)酵方式有關(guān)外，這與100%大麥麥汁中這5種老化醛本身的含量低也有直接關(guān)系。這也預(yù)示著100%大麥啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性（新鮮度）優(yōu)于麥芽啤酒。

2.3 自由基含量的分析

電子自旋共振法（ESR）是可以直接定量測定自由基（free radical，F(xiàn)R）的技術(shù)方法。啤酒氧化是一系列的生化反應(yīng)的結(jié)果，極其復(fù)雜，利用ESR技術(shù)對啤酒的抗氧化力進(jìn)行評估較其他方法更準(zhǔn)確。ESR檢測自由基結(jié)果示意圖見圖1。

自由基從少量到大量產(chǎn)生的拐點(diǎn)所對應(yīng)的時(shí)間就是遲滯時(shí)間（lagtime），其值大小反映出了啤酒的內(nèi)源抗氧化能力（endogenousantioxidativepotential，EAP），用來預(yù)測啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性的時(shí)間（風(fēng)味保鮮期），此值越大表示啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性越好。T150是150 min時(shí)檢測到的自由基強(qiáng)度，此值越小，說明自由基含量越少；同樣，在相同的時(shí)間，所對應(yīng)的自由基強(qiáng)度的峰面積積分越小，說明自由基含量越少，而樣品本身的內(nèi)源抗氧化能力越高，則啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性會(huì)更好。利用ESR電子自旋共振儀對100%大麥麥汁和100%麥芽麥汁中自由基也分別進(jìn)行了檢測，數(shù)據(jù)結(jié)果見表7。

圖1ESR檢測自由基結(jié)果示意圖Fig.1 Sketch map of free radicals intensity by ESR

表7 麥汁自由基的檢測結(jié)果Table 7 Determination results of free radicals in wort

由表7可知，T150值看出麥芽麥汁是大麥麥汁的2.94倍；從峰面積來看，麥芽麥汁是大麥麥汁的2.80倍。這說明，麥芽麥汁的自由基含量遠(yuǎn)高于大麥麥汁，幾乎是大麥麥汁自由基含量的3倍，即大麥麥汁的內(nèi)源性抗氧化能力是麥芽麥汁的近3倍，也預(yù)示大麥啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性（風(fēng)味保鮮期）要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于麥芽啤酒。與李崎等[15]得到的同重量麥芽的自由基量多于大麥，制麥過程的較高溫度促進(jìn)了自由基生成并積累的結(jié)論一致。

3 結(jié)論

就麥汁而言，100%大麥麥汁中老化Strecker醛的含量明顯低于100%麥芽麥汁；同樣的麥汁，上面發(fā)酵方式還原Strecker醛的能力明顯優(yōu)于下面發(fā)酵方式。就啤酒而言，經(jīng)酵母還原后，新鮮啤酒中的老化Strecker醛含量較麥汁含量低，且100%大麥啤酒中老化Strecker醛的含量低于100%麥芽啤酒。100%麥芽麥汁的自由基含量是100%大麥麥汁的近3倍。這都預(yù)示著100%大麥啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性（新鮮度）明顯好于100%麥芽啤酒。

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Aging Strecker aldehydes in 100%barley beer brewing

ZHU Mingguang,WANG Min*
(College of Bioengineering,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

100%barley beer and 100%malt beer were brewed with top-fermentation and bottom-fermentation technology,respectively.The content of amino acids,aging Strecker aldehydes,free radicals in wort,as well as aging Strecker aldehydes content in fresh beers were analyzed.Results showed that in terms of wort,the content of aging Strecker aldehydes was much lower in 100%barley wort than in 100%malt wort,and the ability of reducing Strecker aldehydes was obviously better with top-fermentation process than with bottom-fermentation process.It was also found that in terms of beer,the content of aging Strecker aldehydes in beers brewed with 100%barley was lower than those with 100%malt.The free radical level in 100%malt wort was nearly 3 times of that in 100%barley wort.All above results indicated that 100%barley beer has much better flavor stability (freshness)than 100%malt beer.

100%barley brewing;Strecker aldehydes;free radicals;amino acids

TS262.5

0254-5071（2017）06-0028-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.006

2017-03-08

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃‘863計(jì)劃’（2013AA102106）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31471722）；教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”項(xiàng)目（IRT15R49）；天津市科技支撐計(jì)劃（16YFZCNC00650）

朱明光（1971-），男，工程師，博士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：王敏（1971-），女，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。