白血病微衛(wèi)星不穩(wěn)定與靶基因移碼突變的研究

母光福，李文錦，李璨，陳方平

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 血液科，湖南 長沙 410008）

白血病微衛(wèi)星不穩(wěn)定與靶基因移碼突變的研究

母光福，李文錦，李璨，陳方平

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 血液科，湖南 長沙 410008）

目的 探究微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）的急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）中SETD1B和TTK基因微衛(wèi)星序列移碼突變的情況。方法采用熒光片段聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)ALL細(xì)胞株和臨床樣本行MSI檢測。采用基因測序和熒光片段PCR檢測SETD1B、TTK基因微衛(wèi)星序列的移碼突變。結(jié)果ALL細(xì)胞株MSI陽性率為80.0%（4/5）；兒童ALL患者骨髓樣本MSI陽性率為25.0%（3/12）；成人ALL患者骨髓樣本MSI陽性率為20.0%（2/10）。Molt4細(xì)胞株中SETD1B基因微衛(wèi)星序列存在移碼突變c.22delC，TTK基因微衛(wèi)星序列存在移碼突變c.2560delA；CCRF-CEM細(xì)胞株中SETD1B基因微衛(wèi)星序列存在移碼突變c.22delC；ALL患者骨髓樣本中SETD1B和TTK基因微衛(wèi)星序列均未檢測到上述移碼突變。結(jié)論MSI誘導(dǎo)SETD1B和TTK基因微衛(wèi)星序列移碼突變可發(fā)生于ALL細(xì)胞株。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定；白血病；移碼突變

微衛(wèi)星是短串聯(lián)重復(fù)DNA序列，微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）是微衛(wèi)星序列重復(fù)數(shù)目的改變[1]。含SET結(jié)構(gòu)域蛋白1B（SET domain containing 1B，SETD1B）基因編碼蛋白參與催化組蛋白H3第4位賴氨酸（histone H3 lysine 4，H3K4）甲基化[2]。酪氨酸蘇氨酸激酶（tyrosine threonine kinase，TTK）基因編碼蛋白參與有絲分裂檢測點(diǎn)功能[3]。MSI誘導(dǎo)SETD1B、TTK基因移碼突變參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）中也存在 MSI現(xiàn)象，但是否存在SETD1B、TTK基因移碼突變尚不清楚[6]。本研究通過熒光片段聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）與基因測序檢測ALL中MSI現(xiàn)象與SETD1B、TTK基因的移碼突變。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人 ALL 細(xì) 胞 株 REH、Molt4、Daudi、Jurkat、CCRF-CEM及人結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO購自上海中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，胎牛血清（美國Hyclone公司），無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）（美國 Hyclone 公司），MEM/EBSS液體培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Gibco公司），淋巴細(xì)胞分離液（北京賽馳生物科技有限公司），QIAamp DNA Blood Mini Kit（德國 Qiagen公司），2×Phanta Max Master Mix（南京諾唯贊生物科技公司），Roche Fast Start Taq DNA polymerase（瑞士 Roche 公司），2.5×Buffer（北京閱微基因技術(shù)有限公司），ROX-500分子量內(nèi)標(biāo)（北京閱微基因技術(shù)有限公司）。SETD1B基因第1外顯子正向引物：5'-CTGCCGATTGGATTCTTTCGCG TG-3'，反向引物：5'-CTCGAGGCACTTGTCAAACTC CAG-3'；TTK基因第22外顯子正向引物：5'-GAAC ACTATAGTGGTGGTGAAAGTC-3'，反向引物：5'-TA TACAGTGCCATAAGTGGTTGC-3'均由上海捷瑞公司合成。SETD1B基因第1外顯子熒光片段PCR正向引物：FAM-5'-GATTCTTTCGCGTGTGTGTAGA-3'，反向 引 物 ：5'-GGGTCAATCATCAACTTGTAACTT-3'；TTK基因第22外顯子熒光片段PCR正向引物：FAM-5'-TTCCCAACTGTAAGAACAAGAGAGA-3'，反向引物：5'-TTGCTGATAACACTTCAGAGTGATG-3'均由北京閱微基因技術(shù)有限公司合成。Gene Amp 9700 PCR儀、3130xl DNA analyzer儀均購自美國ABI公司，穩(wěn)壓DNA電泳儀（美國BioRad公司），凝膠成像儀（上海天能公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將 REH、Molt4、Daudi、Jurkat、CCRF-CEM 細(xì)胞株培養(yǎng)于含12%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將RKO細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM/EBSS液體培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 臨床樣本及健康志愿者樣本

選取2016年9月1日-2017年2月20日在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院初診的22例ALL患者，年齡2～68歲，平均19.1歲；其中兒童12例（年齡＜14歲），成人10例（年齡≥14歲）；女性7例，男性15例；低危或標(biāo)危3例，高危19例；B細(xì)胞ALL 19例，T細(xì)胞ALL 3例；采集骨髓樣本于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-K3 抗凝管中，采用淋巴細(xì)胞分離液法分離單個(gè)核細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。10例健康志愿者，年齡21～46歲，平均31.6歲，其中男性4例，女性6例，采集外周血樣本于EDTA-K3抗凝管中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；患者或家屬、健康志愿者均簽署知情同意書，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 DNA提取

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞或原代骨髓單個(gè)核細(xì)胞，懸浮于200μl磷酸鹽緩沖溶液中，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit說明書提取基因組DNA。取200μl健康志愿者外周血標(biāo)本，按QIAamp DNA Blood Mini Kit說明書提取基因組DNA。

1.5 MSI檢測

以基因組DNA為模板，用熒光片段PCR對(duì)BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27 及 MONO-27 6個(gè)單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，在ABI 3130xl型遺傳分析儀上進(jìn)行分析[7]。

1.6 Sanger測序

加入 2×Phanta master mix 25 μl，正反向引物各 1 μl，基因組 DNA 200 ng，加雙蒸水補(bǔ)足 50 μl，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像后在ABI 3130xl型遺傳分析儀上進(jìn)行結(jié)果分析。

1.7 熒光片段PCR檢測

加 入 2.5 ×Buffer 4 μl，Roche Fast Start Taq DNA polymerase 0.2 μl，正反向引物各 1 μl，基因組DNA 100 ng，加雙蒸水補(bǔ)足 10 μl，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，采用熒光標(biāo)記的引物在Gene Amp 9700 PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI 3130xl型遺傳分析儀中行片段長度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，用Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALL細(xì)胞株中存在MSI現(xiàn)象

微衛(wèi)星標(biāo)志位點(diǎn)通過熒光片段PCR檢測，微衛(wèi)星標(biāo)志位點(diǎn)PCR產(chǎn)物長度相差≥3 bp的片段為MSI陽性狀態(tài)。80.0%（4/5）ALL細(xì)胞株為MSI陽性，其中 REH、Molt4、Daudi、Jurkat為 MSI陽性細(xì)胞株；CCRF-CEM為MSI陰性細(xì)胞株；對(duì)照組結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO為MSI陽性細(xì)胞株。見附表。

附表 MSI與靶基因移碼突變的關(guān)系

2.2 ALL臨床樣本中存在MSI現(xiàn)象

共納入22例ALL患者，其中12例ALL患兒（年齡＜14歲）根據(jù)初診時(shí)的資料，按照兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議（第4次修訂）標(biāo)準(zhǔn)[8]，分為低危組、標(biāo)危組及高危組；10例成人ALL患者（年齡≥14歲）根據(jù)初診時(shí)資料，按中國成人急性淋巴細(xì)胞白血病診斷與治療指南（2016年版）標(biāo)準(zhǔn)[9]，分為標(biāo)危組和高危組。初治ALL患兒骨髓樣本MSI陽性率為25.0%（3/12），初治成人ALL患者骨髓樣本MSI陽性率為20.0%（2/10），經(jīng)Fisher確切概率法，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）；女性患者骨髓樣本MSI陽性率為14.3%（1/7），男性患者骨髓樣本MSI陽性率為26.7%（4/15），經(jīng)Fisher確切概率法，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）；低危或標(biāo)危組ALL患者骨髓樣本MSI陽性率為33.3%（1/3），高危組ALL患者骨髓樣本MSI陽性率為21.1%（4/19），經(jīng)Fisher確切概率法，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）；B細(xì)胞ALL患者骨髓樣本MSI陽性率為21.1%（4/19），T細(xì)胞ALL患者骨髓樣本MSI陽性率為33.3%（1/3），經(jīng)Fisher確切概率法，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）。10例健康志愿者外周血標(biāo)本均為MSI陰性。

2.3 基因測序在ALL細(xì)胞株中檢測到SETD1B和TTK基因移碼突變

在Molt4細(xì)胞株中SETD1B基因第1外顯子C8微衛(wèi)星序列存在移碼突變c.22delC，TTK基因第22外顯子A9微衛(wèi)星序列存在移碼突變c.2560delA；在CCRF-CEM細(xì)胞株中SETD1B基因第1外顯子C8微衛(wèi)星序列存在移碼突變c.22delC，TTK基因第22外顯子A9微衛(wèi)星序列為野生型；在RKO細(xì)胞株中SETD1B基因第1外顯子C8微衛(wèi)星序列存在突變c.22delC，TTK基因第22外顯子A9微衛(wèi)星序列存在突變 c.2560delA；在 REH、Daudi、Jurkat細(xì)胞株中SETD1B第1外顯子C8微衛(wèi)星序列、TTK基因第22外顯子A9微衛(wèi)星序列均為野生型（見圖1、2）。22例ALL原代骨髓單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA及10例健康志愿者外周血基因組DNA中SETD1B第1外顯子C8微衛(wèi)星序列、TTK基因第22外顯子A9微衛(wèi)星序列均為野生型。

2.4 熒光片段PCR在ALL細(xì)胞株中檢測到SETD1B和TTK基因移碼突變

在Molt4細(xì)胞株中，SETD1B基因第1外顯子C8微衛(wèi)星序列存在2個(gè)片段長度，該2個(gè)片段長度相差1 bp，TTK基因第22外顯子A9微衛(wèi)星序列存在2個(gè)片段長度，該2個(gè)片段長度相差1bp；在CCRFCEM細(xì)胞株中，SETD1B基因第1外顯子C8微衛(wèi)星序列存在2個(gè)片段長度，該2個(gè)片段長度相差1 bp，TTK基因第22外顯子A9微衛(wèi)星序列片段僅存在1個(gè)片段長度；在RKO細(xì)胞株中，SETD1B基因第1外顯子C8微衛(wèi)星序列存在2個(gè)片段長度，該2個(gè)片段長度相差1 bp，TTK基因第22外顯子A9微衛(wèi)星序列存在2個(gè)片段長度，該2個(gè)片段長度相差2 bp；在 REH、Daudi、Jurkat細(xì)胞株中，SETD1B 基因第 1外顯子C8微衛(wèi)星序列有且僅有1個(gè)片段長度，TTK基因第22外顯子A9微衛(wèi)星序列有且僅有1個(gè)片段長度（見圖3、4）。22例ALL原代骨髓單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA及10例健康志愿者外周血基因組DNA中SETD1B基因第1外顯子C8微衛(wèi)星序列有且僅有1個(gè)片段長度，TTK基因第22外顯子A9微衛(wèi)星序列有且僅有1個(gè)片段長度。

圖1 SETD1B基因第1外顯子C8微衛(wèi)星序列Sanger測序

圖2 TTK基因第22外顯子A9微衛(wèi)星序列Sanger測序

圖3 SETD1B基因第1外顯子C8微衛(wèi)星序列熒光片段

圖4 TTK基因第22外顯子A9微衛(wèi)星序列熒光片段

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過6個(gè)單堿基串聯(lián)序列位點(diǎn)BAT25、BAT26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO27 檢測白血病細(xì)胞的微衛(wèi)星狀態(tài)，發(fā)現(xiàn) REH、Molt4、Jurkat、Daudi細(xì)胞株均為MSI陽性，與HAM等[10]報(bào)道的結(jié)果一致。BEST等[6]報(bào)道，CCRF-CEM細(xì)胞株是MSI陽性，而本研究中CCRF-CEM細(xì)胞株被認(rèn)定為MSI陰性，這可能與微衛(wèi)星標(biāo)志位點(diǎn)選擇差異相關(guān)。MSI現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于結(jié)直腸腫瘤中，其在結(jié)直腸癌中的研究較為成熟，具備較完善的MSI狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。對(duì)于白血病，目前尚無統(tǒng)一的MSI狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)，同一細(xì)胞株微衛(wèi)星狀態(tài)在不同的研究報(bào)道可不一致。因此，在白血病中尚需尋找高敏感性、高特異性的MSI的檢測標(biāo)志組合。

本研究發(fā)現(xiàn)，初治ALL患者的MSI陽性率較低，其中初治ALL患兒骨髓樣本MSI陽性率為25.0%，初治成人ALL骨髓樣本MSI陽性率為20.0%，與SELLICK等[11]的報(bào)道一致。本研究樣本量較小，缺乏復(fù)發(fā)難治ALL患者中MSI發(fā)生的資料，但有研究報(bào)道MSI更易發(fā)生于復(fù)發(fā)或繼發(fā)白血病[12-13]。本研究還發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞ALL骨髓樣本MSI陽性率為21.0%，T細(xì)胞ALL骨髓樣本MSI陽性率為33.3%，B細(xì)胞白血病的MSI陽性率比T細(xì)胞白血病低，與INOUE等[14]的報(bào)道一致。有研究報(bào)道，MSI陽性的白血病傾向于發(fā)生在免疫抑制狀態(tài)的患者[15]?？偨Y(jié)既往研究可發(fā)現(xiàn)，血液腫瘤的MSI陽性率比實(shí)體腫瘤低，原發(fā)和初治白血病的MSI陽性率比繼發(fā)和復(fù)發(fā)白血病低，髓系白血病MSI陽性率比淋系白血病低，B細(xì)胞白血病MSI陽性率比T細(xì)胞白血病低。這是因?yàn)镸SI導(dǎo)致靶基因移碼突變所產(chǎn)生的異常蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性活化T細(xì)胞，反而抑制MSI陽性細(xì)胞的生存[16]。腫瘤細(xì)胞誘發(fā)免疫應(yīng)答的能力與機(jī)體的免疫狀態(tài)造成不同腫瘤MSI陽性率的差異?；谠撚^點(diǎn)，有研究者嘗試運(yùn)用MSI陽性白血病中的異常蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性活化的T細(xì)胞，對(duì)該疾病進(jìn)行免疫治療[17]。MSI陽性白血病的靶向免疫治療處于初始階段，仍需要更多研究闡明其機(jī)制。

在急性白血病中，MSI的靶基因包括轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅱ類（transforming growth factor-β receptor typeⅡ，TGFβRⅡ）基因、雙鏈斷裂修復(fù)MRE11 基因等[10，14，18]。本研究通過 Sanger測序及熒光片段PCR 2種獨(dú)立的方法，首次報(bào)道在Molt4、CCRF-CEM細(xì)胞株中SETD1B基因存在移碼突變c.22delC。但在22例ALL臨床骨髓樣本中，未檢測到該突變，這可能是因?yàn)闃颖玖刻?，或該突變的發(fā)生率不高所致。SETD1B是一種重要的組蛋白甲基化相關(guān)基因，其編碼的蛋白是組蛋白H3K4位點(diǎn)甲基化的重要催化酶[2]。組蛋白甲基化異常是白血病發(fā)生、發(fā)展的重要因素[19]。SETD1B基因移碼突變是否會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)異常，以及如何參與白血病的發(fā)生、發(fā)展，仍需進(jìn)一步研究闡明。本研究通過Sanger測序及熒光片段PCR 2種獨(dú)立的方法，發(fā)現(xiàn)在Molt4細(xì)胞株中TTK基因存在突變c.2560delA。本研究在22例ALL臨床骨髓標(biāo)本中未檢測到該突變，這可能是因?yàn)闃颖玖刻?，或該突變的發(fā)生率不高所致。TTK所編碼的蛋白激酶，主要參與有絲分裂中紡錘體形成檢測點(diǎn)功能，確保姐妹染色單體連接在紡錘體上后，才啟動(dòng)有絲分裂后期[20-21]。有絲分裂中紡錘體形成檢測點(diǎn)功能的異常可發(fā)生于乳腺癌、結(jié)直腸癌等實(shí)體腫瘤中[5，22]。CAMACHO等[23]在淋巴瘤中也發(fā)現(xiàn)TTK基因突變，但該突變并非是MSI誘導(dǎo)的移碼突變。在白血病中，MSI誘導(dǎo)的TTK基因移碼突變是否會(huì)影響其表達(dá)與功能仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（童穎丹 編輯）

Microsatellite instability and target gene frameshift mutations in leukemia

Guang-fu Mu,Wen-jin Li,Can Li,Fang-ping Chen
(Department of Hematology,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China)

ObjectiveTo investigate frameshift mutations of microsatellite sequence inSETD1BandTTK genes in acute lymphoblastic leukemia (ALL)with microsatellite instability (MSI).MethodsFluorescent fragment PCR was used for defining the microsatellite status of ALL cells both in cell lines and bone marrow samples.Sanger sequencing and fluorescent fragment PCR were used for the detection of frameshift mutations of microsatellite sequences inSETD1BandTTKgenes in ALL cells with MSI both in cell lines and bone marrow samples.ResultsThe incidence of MSI in the ALL cell line was 80.0% (4/5).The incidence of MSI in the child ALL cells was 25.0% (3/12).The incidence of MSI in the adult ALL was 20.0%(2/10).Frameshift mutations of c.22delC inSETD1Bgene and c.2560delA inTTKgene were detected in Molt4 cell line.Frameshift mutation of c.22delC inSETD1Bgene was detected in CCRF-CEM cell line.None of the above frameshift mutations was detected in the ALL bone marrow samples.ConclusionsMSI inducedSETD1B andTTKgene frameshift mutations occur in the ALL cell lines.

microsatellite instability;leukemia;frameshift mutation

R733.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.008

1005-8982（2017）12-0040-06

2017-02-15

陳方平，E-mail：xychenfp@qq.com；Tel：13707485350