長鏈非編碼RNA PRNCR1對胃癌細胞增殖、侵襲及轉移的研究

蔡毅

（南華大學附屬第一醫(yī)院 急診內科，湖南 衡陽 421001）

長鏈非編碼RNA PRNCR1對胃癌細胞增殖、侵襲及轉移的研究

蔡毅

（南華大學附屬第一醫(yī)院 急診內科，湖南 衡陽 421001）

目的 探索胃癌MGC-803細胞和人正常胃黏膜上皮GES-1細胞中，長鏈非編碼RNA PRNCR1的表達，以及沉默PRNCR1對胃癌MGC-803細胞增殖、侵襲及遷移的影響。方法利用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測細胞中PRNCR1表達水平；設計并合成PRNCR1-siRNA及對照序列（PRNCR1-NC）轉染胃癌細胞，通過qRT-PCR檢測細胞中PRNCR1的沉默效果；利用四甲基偶氮唑鹽比色法檢測胃癌細胞的增殖；Transwell實驗檢測胃癌細胞遷移和侵襲能力的變化。結果PRNCR1在胃癌MGC-803細胞中的表達高于人正常胃黏膜上皮GES-1細胞，PRNCR1-siRNA可以下調胃癌MGC-803細胞中PRNCR1的表達，并可以抑制MGC-803細胞的增殖和侵襲轉移能力。結論PRNCR1-siRNA能夠下調PRNCR1的表達，并有效抑制胃癌細胞的增殖和侵襲遷移力，為以PRNCR1為靶點的胃癌基因治療奠定理論基礎。

長鏈非編碼RNA；前列腺癌非編碼RNA1；增殖；侵襲；轉移；胃癌

胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，占全部惡性 腫瘤的第3位，居消化道惡性腫瘤的首位，占胃惡性腫瘤的95%。早期胃癌多無癥狀或僅有輕微癥狀，當臨床癥狀明顯時，病變已屬晚期。由此可見，胃癌嚴重威脅著人類的健康[1]。目前，胃癌的致病基因、發(fā)病機制及影響預后的因素仍不清楚，因此尋找胃癌發(fā)生、發(fā)展的致病因素具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類不具有蛋白質編碼功能、長度＞200 nt的RNA。最新研究顯示，lncRNA并非既往認為的“噪音”RNA，而是在生物進化過程中高度保守，具有重要調控功能的非編碼RNA[2]。前列腺癌非編碼RNA1（prostate cancer non-coding RNA 1，PRNCR1）定位于染色體8q24，長約13 kB，已經被證實在前列腺癌、結腸癌中發(fā)揮重要作用[3]。最新研究發(fā)現，PRNCR1的基因多態(tài)性與胃癌的患病風險有關[4]。但PRNCR1在胃癌中的作用尚不清楚。本實驗通過探索PRNCR1在胃癌細胞和人正常胃黏膜上皮細胞中的表達，并通過RNA干涉技術沉默胃癌細胞中PRNCR1的表達，檢測其對胃癌細胞增殖、侵襲及轉移能力的影響，為將PRNCR1分子作為胃癌基因治療靶點提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Trizol細胞裂解液購于北京博潤萊特科技有限公司，RNA反轉錄試劑、實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司，細胞轉染試劑購自美國Invitrogen公司，四甲基偶氮唑鹽比色法[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]試劑購自美國Promega公司，細胞侵襲轉移檢測transwell小室購自美國Milipore公司，基質膠購自美國Sigma公司，MGC-803細胞、GES-1細胞購自上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 PRNCR1-siRNA的設計和合成 根據PRNCR1序列，按照siRNA作用靶點設計原則，利用美國Invitrogen公司的siRNA作用靶點設計軟件，委托上海吉瑪基因股份有限公司合成相應的siRNA及對照序列，分別為PRNCR1-siRNA、PRNCR1-NC。1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染 MGC-803細胞、GES-1細胞用含100 ml/L胎牛血清的達爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM），于37℃、50 ml/L二氧化碳CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。適量MGC-803細胞接種在25mm2培養(yǎng)皿中，待細胞密度達70%～80%后，將合成的PRNCR1-siRNA、PRNCR1-NC經Lipofectamine 2000轉染至MGC-803細胞中，具體操作按Lipofectamine 2000試劑盒說明書操作。轉染后的細胞分別為PRNCR1-siRNA組和PRNCR1-NC組。

1.2.3 qRT-PCR檢測PRNCR1的表達 利用qRT-PCR對PRNCR1表達進行檢測。收集轉染48 h后的細胞，利用Trizol細胞裂解液提取細胞，得總RNA，并反轉錄為cDNA。PRNCR1定量PCR引物。正向引物：5'-CCAGGGGGAAACACACAG-3'；反向引物：5'-AAATGGCAGTTTCCTTCAATG-3'。β-actin作為看家基因，正向引物：5'-TTGGCTTGACTCAGG ATTTA-3'，反向引物：5'-ATGCTATCACCTCCCCTGT G-3'。引物序列合成由深圳華大基因公司完成。反應條件：95℃預變性 4 min，95℃變性 12 s，59℃退火35s，共41個循環(huán)。每組3個復孔，實驗重復3次，將所得數據繪制成柱狀圖。

1.2.4 MTT實驗檢測MGC-803細胞增殖 取轉染48 h后且處于對數生長期的MGC-803細胞，常規(guī)洗滌2遍，用胰蛋白酶消化細胞，離心重懸后制成單細胞懸液，并調整細胞濃度為3×104個/ml，加入細胞懸液200 μl/孔，每組設7個復孔。共培養(yǎng)5個96孔板，分別培養(yǎng)1～5 d，檢測1板/d。每天于實驗結束前4 h，加入5 mg/ml MTT 20 μl/孔，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μl/孔，震蕩 11 min，使 MTT 的還原產物充分溶解，于490 nm處測定細胞的光密度（optical density，OD）值。

1.2.5 Transwell實驗檢測MGC-803細胞侵襲和轉移能力 MGC-803細胞轉染48 h后，通過Transwell實驗檢測細胞侵襲和轉移力的變化，每組設3個復孔。胰蛋白酶消化各組細胞，無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗 3遍，離心后用牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）10 g/L 無血清培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞密度調整為1×105個/ml，事先用基質膠包被好Transwell小室中上室的基底膜，每組細胞懸液中取150 μl加入上室中，將小室放入24孔板中，下室中加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl，培養(yǎng) 36 h。結束后，將小室取出，PBS 輕輕沖洗，棉簽擦去小室上室內層的細胞，95%乙醇固定6 min，4 g/L結晶紫溶液染色后，倒置顯微鏡下計數，每樣本隨機選取5個視野進行計數后取平均值，繪制柱狀圖。檢測MGC-803細胞轉移能力時，小室的上室中無需基質膠包被基底膜，其他步驟與上述方法相同。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗或重復測量設計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1PRNCR1在MGC-803細胞中高表達

收集對數生長期的MGC-803和GES-1細胞，提取細胞總RNA，qRT-PCR檢測PRNCR1的表達。結果顯示，經標準化后，GES-1細胞PRNCR1相對表達量為（1.000±0.051），MGC-803細胞PRNCR1相對表達量為（3.146±0.783），經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.844，P=0.017），與GES-1細胞比較，PRNCR1在MGC-803細胞中高表達。見圖1。

2.2 PRNCR1-siRNA下調MGC-803細胞中PRNCR1的表達

PRNCR1-siRNA及對照序列轉染MGC-803細胞后48 h，抽提細胞總RNA，qRT-PCR檢測其表達。結果顯示，經標準化后，PRNCR1-NC組PRNCR1相對表達量為（1.000±0.153），PRNCR1-siRNA 組細胞PRNCR1相對表達量為（0.488±0.091），經 t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.841，P=0.009），PRNCR1-siRNA組PRNCR1表達較PRNCR1-NC組下調。見圖2。

圖1 細胞中PRNCR1的表達 （±s）

圖2 兩組細胞PRNCR1表達變化 （n=3，±s）

2.3 PRNCR1-siRNA抑制MGC-803細胞增殖

MTT實驗檢測PRNCR1-siRNA對MGC-803細胞增殖的影響，PRNCR1-siRNA與PRNCR1-NC組術后 24、48、72、96和 124 h測量的 OD 值比較，采用重復測量數據的方差分析，結果：①不同時間點的OD值有差異（F=8.105，P=0.014）；②PRNCR1-iRNA組與PRNCR1-NC組的OD值有差異（F=16.217，P=0.008），PRNCR1-siRNA組較PRNCR1-NC組OD值低，增殖速度較慢；③PRNCR1-siRNA組與PRNCR1-NC組的OD值變化趨勢有差異（F=7.814，P=0.032），從檢測后第3天開始，PRNCR1-siRNA組細胞的增殖速度較PRNCR1-NC組緩慢。見圖3和附表。

2.4 PRNCR1-siRNA抑制MGC-803細胞的侵襲

圖3 PRNCR1-siRNA對細胞增殖的影響

附表 兩組各時間點OD值比較 （n=3，±s）

附表 兩組各時間點OD值比較 （n=3，±s）

組別120 h PRNCR1-NC 組 0.481±0.100 0.863±0.090 1.501±0.121 2.407±0.104 2.901±0.201 PRNCR1-siRNA組 0.503±0.171 0.804±0.221 1.201±0.221 1.614±0.107 1.915±0.224 24 h 48 h 72 h 96 h

PRNCR1-siRNA及對照序列轉染MGC-803細胞48h后，結果顯示，PRNCR1-siRNA組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目為（21.635±7.424）個/高倍鏡，PRNCR1-NC組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目為（52.471±9.518）個/高倍鏡，經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.471，P=0.025），PRNCR1-siRNA組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目少于PRNCR1-NC組。說明沉默PRNCR1表達后，可以抑制MGC-803細胞的侵襲能力。見圖4。

2.5PRNCR1-siRNA抑制MGC-803細胞遷移

PRNCR1-siRNA及對照序列轉染MGC-803細胞48 h后，PRNCR1-siRNA組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目為（23.534±5.176）個/高倍鏡，PRNCR1-NC組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目為（41.512±8.873）個 /高倍鏡，經 t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.214，P=0.017），PRNCR1-siRNA組穿過Matrigel包被的微孔膜的細胞數目少于PRNCR1-NC組，說明沉默PRNCR1表達后，可以抑制MGC-803細胞的遷移能力。見圖5。

圖4 MGC-803細胞侵襲能力的變化

圖5 MGC-803細胞遷移能力的變化

3 討論

lncRNA僅僅是RNA聚合酶Ⅱ的轉錄副產物，在生物體內沒有任何生物學功能，但最近發(fā)現，lncRNA不僅可在多種層面上對基因的表達進行調控，而且與多種疾病的發(fā)生密切相關。目前大量相關研究證實，lncRNA的異常表達會導致其調控的下游功能基因異常表達，最終導致機體產生嚴重的病理變化，更有甚者誘導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。肺腺癌轉移相關轉錄子-1（metastasis-associated lung adenocar cinoma transcript-1，MALAT-1）是一類存在于細胞核內的長鏈非編碼RNA。研究證實，MALAT-1的異常表達與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，包括宮頸癌、前列腺癌、胰腺癌等，并與一些腫瘤的遠處轉移、術后復發(fā)及藥物治療耐藥有關[6]。PRENSNER等[7]研究發(fā)現，在前列腺癌中長鏈非編碼RNA PCGEM1過表達，PCGEM1可促進前列腺癌細胞的惡性增殖，并與患者的不良預后相關。lncRNAs可以在人的循環(huán)血液中檢測到，并在腫瘤中異常表達，說明lncRNAs很可能成為腫瘤的特異性診斷標志物。有研究報道，與健康對照組血清比較，長鏈非編碼RNA XLOC_006844、LOC152578及 XLOC_000303在結腸癌患者血清中表達升高，提示這3種lncRNAs很可能成為結腸癌診斷的新指標[8]。循環(huán)血清中的lncRNA HOTAIR可以作為乳腺癌早期診斷的生物學指標[9]。由此可見，lncRNAs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著至關重要的作用。

lncRNAs在胃癌的研究中也有許多研究進展，LIU等[10]研究發(fā)現，H19通過RUNX1促進胃癌的增殖和侵襲。PANDAR的高表達預示著胃癌患者預后不良[11]。LI等[12]發(fā)現，PRNCR1的基因多態(tài)性可能是胃癌的一個致病因素。但PRNCR1在胃癌中的作用并不清楚，因此，研究其在胃癌細胞中的表達及其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，將有助于更加全面地了解胃癌發(fā)生、發(fā)展的原因。

2011年，CHUNG 等[13]研究發(fā)現，PRNCR1 基因在前列腺癌細胞中表達上調，沉默前列腺癌細胞中PRNCR1的表達，可降低雄激素受體（androgen receptor，AR）的轉錄活性，表明PRNCR1在前列腺癌中通過調控AR的轉錄活性促進前列腺癌的發(fā)生。有研究顯示，PRNCR1的基因多態(tài)性與結腸癌及胃癌的易感性相關[14]。此外，PRNCR1表達上調可以促進結腸癌細胞的增殖，沉默其表達可以抑制結腸癌細胞的細胞周期。而PRNCR1在胃癌細胞中的作用尚未有研究報道，其作用的分子機制更有待進一步研究。

本實驗合成靶向人PRNCR1基因的雙鏈siRNA序列，直接轉染入胃癌細胞中，通過qRT-PCR檢測轉染后siRNA的沉默效果，通過MTT實驗驗證胃癌細胞增殖能力的變化，通過細胞侵襲轉移實驗驗證胃癌細胞侵襲和遷移能力的變化，最終證實沉默PRNCR1在胃癌細胞中的表達可以抑制胃癌細胞的增殖、侵襲及轉移能力，為以PRNCR1為靶點的胃癌基因治療奠定理論基礎。

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[12]LI L,SUN R,LIANG Y,et al.Association between polymorphisms in long non-coding RNA PRNCR1 in 8q24 and risk of colorectal cancer[J].J Exp Clin Cancer Res.2013,32(1):104.

[13]CHUNG S,NAKAGAWA H,UEMURA M,et al.Association of a novel long non-coding RNA in 8q24 with prostate cancer susceptibility[J].Cancer Sci,2011,102(1):245-252.

（童穎丹 編輯）

Long non-coding RNA PRNCR1 promotes proliferation,invasion and migration of gastric cancer cells

Yi Cai
(Department of Emergency,the First Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

ObjectiveTo observe the expressions of long non-coding RNA PRNCR1 in gastric cancer MGC-803 cells and normal gastric mucosa epithelial GES-1 cells,and to study the effect of PRNCR1 on the proliferation,migration and invasion of gastric cancer cells by silencing the expression of PRNCR1.MethodssiRNA fragments (PRNCR1-siRNA)and control fragments (PRNCR1-NC)were designed,synthesized and transfected to gastric cancer cells.The expression of PRNCR1 was detected by qRT-PCR.Cell proliferation was detected by MTT.Migration and invasion of gastric cancer cells were detected by Transwell assay.ResultsThe expression of PRNCR1 in the MGC-803 cells was higher than that in the GES-1 cells.The expression of PRNCR1 was reduced by PRNCR1-siRNA in the MGC-803 cells.The proliferation,invasion and migration of the MGC-803 cells decreased after transfection of PRNCR1-siRNA.ConclusionsThe expression of PRNCR1 can be down-regulated by PRNCR1-siRNA,and PRNCR1-siRNA could inhibit the proliferation,invasion and migration of gastric cancer cells,which provides a theoretical foundation for gene therapy of gastric cancer targeting atPRNCR1gene.

long non-coding RNA;PRNCR1;proliferation;invasion;migration;gastric cancer

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.007

1005-8982（2017）12-0035-05

2016-04-15