基于結腸黏膜ICAM-1探討芍藥湯對潰瘍性結腸炎（胃腸濕熱證）大鼠的作用機制*

羅敏杜英杰吳強胡響當林仁敬楊宗亮李帥軍何永恒

（1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南長沙410005；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410007）

·研究報告·

基于結腸黏膜ICAM-1探討芍藥湯對潰瘍性結腸炎（胃腸濕熱證）大鼠的作用機制*

羅敏1△杜英杰2吳強2胡響當1林仁敬1楊宗亮1李帥軍1何永恒1

（1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南長沙410005；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410007）

目的采用RT-PCR和Western-blot檢測細胞間黏附分子-1（ICAM-1）基因生成以及蛋白的表達水平，探討芍藥湯治療潰瘍性結腸炎（UC）可能的作用機制。方法隨機將48只清潔級SD大鼠分為4組，分別為空白組、模型組、西藥對照組（SASP組）以及芍藥湯組，每組12只；模型組、芍藥湯組及SASP組3組大鼠在成功制成胃腸濕熱證模型基礎上，再建立UC模型；造模完成后，各組大鼠分別進行疾病活動指數(shù)（DAI）評分，灌胃治療2周，處死大鼠前對其進行第2次DAI評分，完畢后麻醉并處死各組大鼠；解剖后，取病變的結腸組織觀察，進行組織大體形態(tài)損傷（CMDI）評分；隨后，將病變最明顯結腸組織腸段2 cm左右，平均分為兩等分，分別用于檢測ICAM-1基因的蛋白的表達。結果相比空白組，模型組大鼠的DAI及CMDI評分升高明顯（P＜0.01），治療后芍藥湯組上述積分與模型組相比而言，下降明顯（P＜0.05）；在結腸組織ICAM-1蛋白表達方面，Western-blot結果顯示，模型組大鼠灰度值較空白組明顯下降，治療后，芍藥湯組與SASP組ICAM-1灰度值均有所上升，且與正常組水平相近；大鼠結腸組織中ICAM-1 mRNA生成方面，與空白組相比而言，模型組上升明顯（P＜0.01），而在治療后與模型組相比，芍藥湯組及SASP組ICAM-1 mRNA生成水平顯著降低（P＜0.01）。結論芍藥湯通過抑制UC（胃腸濕熱證）大鼠結腸黏膜組織中ICAM-1基因及蛋白的表達，從而改善UC大鼠的癥狀及體征，這可能是其治療UC的作用機制。

芍藥湯潰瘍性結腸炎細胞間黏附分子-1

炎癥性腸?。↖BD）是對小腸及結腸所處的慢性、自發(fā)的炎癥狀態(tài)的概括，然而其病機尚未明確，目前多認為其為腸道菌群、腸粘膜免疫反應、環(huán)境因素及基因組成等方面的復雜相互作用所導致［1］。目前臨床醫(yī)學認為，IBD主要包括兩種疾病，分別為潰瘍性結腸炎（UC）以及克羅恩?。–D），與CD不同的是，UC病灶多局限于大腸黏膜及黏膜下層［2］。免疫因素在UC發(fā)病中扮演的角色至關重要。正常情況下，體內的抗炎因子以及促炎因子是相對平衡的，這個平衡在一個正常范圍內波動，當其波動超出正常范圍時，兩者失去平衡，導致UC發(fā)?。?］。黏附分子（AMS）家族為一類受體型糖蛋白，一般通過誘導淋巴細胞歸巢和刺激細胞分化參與調節(jié)免疫系統(tǒng)功能，其作用與UC發(fā)病之間的關系越來越受到重視。ICAM-1是黏附分子家族中的一員，其在目前的研究中較受重視，有研究發(fā)現(xiàn)，處于活動期UC患者的外周血中，ICAM-1表達顯著增高，在腸組織中表達亦較明顯，且其表達水平的高低同病情的輕重呈正相關［4］。柳氮磺胺吡啶、激素及免疫抑制劑等是治療UC的常用藥物。近年來，靶向藥物如英弗利希也投入使用，但目前UC的治療效果尚待優(yōu)化。中醫(yī)藥在其中可充分發(fā)揮其價格低廉、雙向調節(jié)劑毒副作用低等優(yōu)勢。芍藥湯是中醫(yī)臨床上用來治療UC（胃腸濕熱證）的常用方之一。本實驗從結腸黏膜組織中ICAM-1出發(fā)，探討芍藥湯治療UC（胃腸濕熱證）大鼠的可能作用機理?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠48只，雄性，體質量180～200 g，由斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2013-0004。使用許可證號：SYXK（湘）2013-0005。所有大鼠進入實驗室后，控制實驗室溫度、適度以及良好通風等，適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 試藥與儀器造模劑2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS），美國Sigma公司；TRIzol試劑、瓊脂，Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、PCR試劑盒，Promega Corporation公司。一抗ICAM-1、SP免疫組化染色試劑盒、DAB染色試劑盒，北京博奧森生物工程開發(fā)有限公司。核酸水平電泳儀；實時定量PCR儀；離心機（Centrifuge 5424 R德國Eppendorf公司）；凝膠成像系統(tǒng)；高速低溫離心機；核酸蛋白濃度測定儀；電泳儀BIORAD；酶標儀；干式恒溫器（K30杭州爽盛儀器）微量移液槍（各種型號，美國Rainin PiPet-Lite）；全自動化學發(fā)光分析儀（Tanon-5200上海，天能）。陽性藥物柳氮磺胺吡啶（SASP）（批號H31020557，劑量0.25/片）。芍藥湯方中各中藥飲片均由湖南中醫(yī)藥大學附屬二院藥房提供，按每毫升藥液含生藥1.2 g的濃度煎制而成。

1.3 造模與分組動物分組，將48只雄性SD大鼠按完全隨機法平均分成4組，分別為空白組、模型組、SASP組及芍藥湯組。除空白組外，另外3組大鼠均參照文獻［5］制成胃腸濕熱模型。胃腸濕熱模型成功建立后，采用三硝基苯磺酸（TNBS）以及40％乙醇按照1∶1的質量比灌腸，建立UC大鼠模型［6］。造模后各組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)。4 d后，各組大鼠中隨機選取1只處死，取大腸沿長軸方向剪開，平鋪進行觀察距離肛緣6～10 cm處是否出現(xiàn)潰瘍面，并通過病理檢查證實此區(qū)域改變?yōu)檠仔愿淖儯瑫r空白組大鼠在該部分結腸黏膜未見上述改變，即可確定造模成功。各組于確定造模后第2日開始，芍藥湯組根據(jù)體重質量比按含生藥量9.2 g/kg灌胃給藥，SASP組根據(jù)體重質量比按含生藥量0.3 g/kg灌胃給藥，上述中西藥均由蒸餾水配制成溶液，然后將配制好的藥液按照10 mL/kg體積比灌胃，空白組、模型組大鼠亦按照10 mL/kg體積比給予0.9％氯化鈉溶液灌胃。連續(xù)給藥14 d，每日1次。

1.4 觀察指標實驗完成后，按照0.4 mL/100 g的比例以質量分數(shù)為10％的水合氯醛行腹腔麻醉，麻醉見效后，解剖大鼠，取下病變明顯處結腸組織2 cm，大致均分為兩部分，分別用于檢測結腸黏膜組織ICAM-1的基因及蛋白的表達水平。觀察指標包括1）確定造模成功后首次灌胃給藥前以及處死麻醉前對各組大鼠進行炎癥活動指數(shù)（DAI）評分［7］；2）對大鼠病變結腸進行組織大體形態(tài)損傷（CMDI）評分［8］；3）Western-blot法檢測大鼠結腸黏膜組織ICAM-1蛋白表達水平：將組織剪成細小的碎片，按照比例加入需要濃度的裂解液，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解完成后，取適量樣品在溫度為4℃，離心機轉速為12000 g的條件下進項持續(xù)離心15 min，其后取上層清亮液，進行蛋白質定量檢測，隨后將其貯存于冰箱中，貯存溫度為-80℃。上述提取的蛋白經(jīng)電泳轉膜后，脫脂奶粉封閉，ICAM-1抗體隨后添入封閉液中，并將其稀釋到目標濃度，在4℃的條件下孵育12 h，再與HRP標記的二抗進行反應。最終ECL化學發(fā)光檢測。然后將膜置于全自動化學發(fā)光分析儀中檢測，顯示的帶掃描后在凝膠影像分析儀上分析條帶。4）RT-PCR法檢測大鼠結腸黏膜組織ICAM-1基因生成水平：Trizol法提取RNA后，對采用RT-PCR法ICAM-1 mRNA進行檢測，上游引物序列5′-GCAGGTGAACTGCTCTTCCT-3′，下游引物序列5′-GTCTTCCCCAATGTCGCTCA-3′，擴增長度130 bp；內參β-actin，上游引物序列5′-ACAACCTTCTTGCAG CTCCTC-3′，下游引物序列5′-CTGACCCATACCCACCATCAC-3′，長度200 bp；采用2-△△Ct法處理結果，并進行統(tǒng)計比較。

1.5 統(tǒng)計學處理應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間兩兩比較若方差齊時選擇配對t檢驗，方差不齊時選擇符號秩和檢驗，相關性分析采用線性回歸。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

最終療程結束前，模型組大鼠死亡2只，芍藥湯組大鼠死亡1只，最終各組大鼠數(shù)目分別為空白組11只、模型組9只、SASP組11只、芍藥湯組10只。

2.1 DAI評分及CMDI評分結果見表1。給藥前經(jīng)造模處理的各組大鼠DAI評分顯著高于空白組（P＜0.01），治療后與模型組和本組治療前比較均顯著下調（P＜0.05）。CMDI評分在治療后SASP組與芍藥湯組大鼠較模型組顯著下調（P＜0.05）。

表1 各組大鼠DAI評分及CMDI評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠DAI評分及CMDI評分比較（分，±s）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與本組治療前比較，△P＜0.05。下同。

DAI評分治療前治療后空白組110.24±0.170.27±0.190.49±0.38組別nCMDI評分模型組93.72±0.91*SASP組102.38±0.85*#3.44±0.49*3.38±0.41*3.39±0.52*2.23±0.39*#△芍藥湯組112.14±0.57*#3.24±0.43*2.17±0.42*#△

2.2 各組大鼠結腸黏膜組織中ICAM-1蛋白水平比較見表2。各治療組大鼠經(jīng)治療后，與模型組大鼠比較均顯著上調（P＜0.01）。

表2 各組大鼠結腸黏膜組織中ICAM-1蛋白灰度值比較（±s）

表2 各組大鼠結腸黏膜組織中ICAM-1蛋白灰度值比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

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2.3 各組大鼠結腸黏膜組織中ICAM-1 mRNA水平比較見表3。各治療組大鼠經(jīng)治療后，與模型組大鼠比較ICAM-1 mRNA水平均顯著下調（P＜0.01）。

3 討論

目前UC是世界衛(wèi)生組織認可的難治病之一［9-10］。ICAM-1作為黏附分子免疫球蛋白超家族中較為重要的一員，在機體處于穩(wěn)定以及平衡條件下，ICAM-1表達水平很低，甚至不表達，只有機體在受到內毒素或者炎性細胞因子刺激后，其可在多種細胞中表達。當細胞過度表達ICAM-1時，血管內皮細胞之間的緊密連接程度較前降低，相互之間的間隙增寬，導致血管壁通透性增加，與此同時大量白細胞向血管邊緣聚集黏附，這使得炎癥細胞大量從血管中向周圍組織滲出，當其到達炎癥部位時，白細胞釋放許多的介導炎癥的細胞因子等，而其他炎癥因子的過度增高亦會刺激ICAM-1的表達，兩者之間形成一個惡性循環(huán)，當缺乏外部條件干擾時，其會使炎癥反應加重惡化［11］。研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在介導炎癥細胞如中性粒細胞募集和趨化的過程中作用是十分重要的。在UC患者疾病處于活動期時，其外周血中ICAM-1的生成表達水平上升明顯，其在結腸黏膜組織中表達也會相應增高，且其表達水平的高低同病情的輕重呈正相關［4］。SASP是磺胺類抗菌藥物中的一種。其口服不易被吸收，在腸微生物作用下，其被分解成5-氨基水楊酸（5-ASA）和磺胺吡啶［12］。5-ASA是該藥的發(fā)揮藥理作用的主要成分，其與腸壁結締組織穩(wěn)定結合并長期停留，發(fā)揮其抑制免疫功能的作用，如有效抑制前列腺素以及其他炎癥介質如白三烯的生成水平，而磺胺吡啶則發(fā)揮其抗菌消炎的功效，抑制大腸桿菌以及梭狀芽胞桿菌，從兩個方面起到治療UC的作用。

表3 各組大鼠結腸黏膜組織ICAM-1mRNA相對表達量比較（2-△△CT，±s）

表3 各組大鼠結腸黏膜組織ICAM-1mRNA相對表達量比較（2-△△CT，±s）

組別n ICAM-1 mRNA相對表達量空白組11模型組9 SASP組10 0.61±0.26 7.50±0.81*1.74±0.31*##芍藥湯組111.83±0.27*##

UC屬于中醫(yī)學“休息痢”范疇。臨床中對于UC（胃腸濕熱證），我們常使用經(jīng)方芍藥湯，療效可觀。芍藥湯功擅清熱燥濕、調和氣血，方中黃芩、黃連清熱燥濕，直指病因之濕熱，二藥共為君藥；芍藥養(yǎng)血和營、柔肝斂陰，當歸養(yǎng)血活血，二藥體顯“行血則便膿自愈”之義，且肝為血海，脾主運化，二藥可使肝之疏泄功能得以正常發(fā)揮，肝臟疏泄正常，不犯脾土，則氣血調和，木香行氣寬中，檳榔行氣導滯，二藥合用發(fā)揮調氣作用治療后重之癥狀。因此上四味共為臣藥；大黃佐助，肉桂佐制；甘草健脾和中，調和諸藥，又可配芍藥以緩里急、止腹痛，為佐使；諸藥合參，使?jié)駸狎屩械溃瑲庋獥l暢通達，從而使得下痢、便膿、腹痛諸癥由此得愈［13-16］。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，芍藥湯對大鼠結腸黏膜組織中ICAM-1基因及蛋白的表達具有負向調節(jié)作用，同時其可明顯地改善UC（胃腸濕熱證）大鼠癥狀及體征。故本研究認為芍藥湯治療UC（胃腸濕熱證）可能是通過抑制大鼠結腸黏膜組織中ICAM-1基因及蛋白的表達來實現(xiàn)的。

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Discussion of the Mechanism of Peony Decoction on Gastrointestinal-syndrome Rats with Ulcerative Colitis Based on Colonic Mucosa ICAM-1

LUO Min，DU Yingjie，WU Qiang，et al.The Second Hospital Affili-ated to Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410005，China.

Objective：To study the feasible mechanism of Peony Decoction on ulcerative colitis by detecting the expression level of gene and protein of Intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）through RT-PCR and Western-blot.Methods：48 clean grade SD rats were randomly divided into the blank group，the model group，Peony Decoction group and SASP group，12 rats in each.Rats in the model group，Peony Decoction group and SASP group were built with Gastrointestinal syndrome，and based on it，they were made into ulcerative colitis model.All rats were marked on DAI after modeling，and after 14 days′lavage treatment，they were marked on DAI for the second time.Then they were narcotized and killed，abnormal tissues with pathological changes were chosen to make CMDI scores；2 cm of each tissue was chosen to detect the expression level of gene and protein of ICAM-1. Results：Compared with the blank group，rats in the model group got a higher level in DAI and CMDI，and the difference was obvious（P＜0.01）.After treatment，DAI scores of rats in Peony Decoction group was lower than those in the model group（P＜0.05）.In the expression of protein of colonic mucosa ICAM-1，grey level of rats in the model group was significantly lower than that in the blank group.After treatment，it rose in SASP group and Peony Decoction group，close to that of the blank group.The expression of mRNA of colonic mucosa ICAM-1 in the model group was significantly higher than those in the blank group（P＜0.01），and after treatment it dropped in SASP group and Peony Decoction group（P＜0.01）.Conclusion：Peony Decoction can obviously suppress theexpression level of mRNA and protein of colonic mucosa ICAM-1，which may be the feasible mechanism of Peony Decoction on Ulcerative colitis.

Peony Decoction；Ulcerative colitis；ICAM-1

R285.5

A

1004-745X（2017）06-0959-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.06.006

2017-03-29）

湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目科研基金課題（2015142）；湖南省教育廳科學研究項目（20171652）；湖南省教育廳重點學科中醫(yī)外科學開放基金課題（湘教發(fā)［2011］76號）

△通信作者（電子郵箱：min3813493@163.com）