蒼術酮對急性肺損傷小鼠血清細胞因子和TLR7信號通路的影響*

陳天陽薛建華侯天祿平鍵胡毅翔成揚△陳建杰

（1.上海市浦東新區(qū)傳染病醫(yī)院，上海201299；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海201203；3.浙江省醫(yī)學科學院，浙江省實驗動物與安全性研究重點實驗室，浙江杭州310013）

·研究報告·

蒼術酮對急性肺損傷小鼠血清細胞因子和TLR7信號通路的影響*

陳天陽1，2薛建華1侯天祿2平鍵2胡毅翔3成揚1，2△陳建杰1，2

（1.上海市浦東新區(qū)傳染病醫(yī)院，上海201299；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海201203；3.浙江省醫(yī)學科學院，浙江省實驗動物與安全性研究重點實驗室，浙江杭州310013）

目的觀察蒼術酮對急性肺損傷（ALI）小鼠血清細胞因子和TRL7信號通路的影響。方法通過呼吸道感染甲型流感病毒，誘導小鼠ALI模型。將144只雄性SPF級ICR小鼠，隨機分為正常組24只，模型組120只。模型組在乙醚麻醉下通過鼻內接種IAV誘導感染，這種病毒在小鼠中引起肺炎，然后隨機平均分為5組，每組24只，分別為模型對照組，利巴韋林治療組，蒼術酮低劑量、中劑量和高劑量治療組。在造模2 h后，陽性藥物組給予利巴韋林50 mg/kg灌胃給藥，蒼術酮高、中、低劑量治療組分別給予蒼術酮40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg灌胃給藥，每日1次，連續(xù)5 d。5 d后處死動物，采集血清以及肺組織樣本。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中IFN-β、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）水平；PCR法測定小鼠肺組織中TLR-7、MyD88、TRAF6、IFN-β mRNA表達水平；Western blot法檢測NF-κB p65蛋白表達水平。結果與正常組比較，模型組小鼠血清中IFN-β、IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著升高（P＜0.01）。與模型對照組比較，利巴韋林組和蒼術酮組IL-6、TNF-α、IL-1β炎癥因子水平均顯著下降，而IFN-β水平顯著升高（P＜0.01），蒼術酮高、低劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型對照組相比，蒼術酮治療組TLR7及其下游基因MyD88，TRAF6和IFN-β的mRNA表達顯著上調（P＜0.01）。此外，Western印跡分析結果顯示，模型對照組的核因子κB（NF-κB）p65蛋白表達水平與正常組相比顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，利巴韋林及蒼術酮各劑量組的蛋白表達顯著減少（P＜0.01）。結論蒼術酮能夠明顯減輕ALI小鼠的肺部炎癥，其作用機制依賴于TLR7信號通路的激活，誘導I型干擾素的產生和對NF-κB p65表達的抑制。

蒼術酮急性肺損傷細胞因子TRL7

急性肺損傷（ALI）是機體在經歷嚴重創(chuàng)傷、感染等打擊后全身炎癥反應綜合征在肺部的表現(xiàn)，可進一步發(fā)展為呼吸衰竭。其病情兇險，臨床治療困難，并且死亡率較高［1］。ALI是流感病毒感染哺乳動物的主要癥狀之一，但是其確切的發(fā)病機制還不是很清楚［2］。蒼術酮是從蒼術中提取和分離出來的。相關研究表明，蒼術酮具有抗流感病毒的作用［3］。本研究以甲型流感病毒感染小鼠，復制小鼠ALI模型，并觀察蒼術酮對ALI小鼠血清細胞因子和TLR7信號通路的影響，探討其作用機制，為進一步開發(fā)安全有效的新藥提供基礎?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與藥物雄性SPF級ICR小鼠，體質量（22.00± 2.00）g，由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（浙）2014-0001。中藥蒼術購自華東藥業(yè)公司，由浙江中醫(yī)藥大學鑒定。標本（編號y20141022）存放在浙江醫(yī)學院藥學系。蒼術酮的分離與提?。翰捎肏A121的超臨界液體萃取儀（華安儀器廠）進行超臨界二氧化碳萃取。取蒼術飲片100 g粉碎成粉末，置于萃取釜內，在350 bar壓力、溫度50℃動態(tài)提取時間持續(xù)60 min，乙醇（99.9％）作為改性劑，流速為5 mL/min。超臨界二氧化碳流速設定為15g/min，靜態(tài)萃取時間設定為30 min。去除溶劑，得到的產物為5.8％。用于體外研究的超臨界二氧化碳萃取物溶于磷酸鹽緩沖液，濃度為1 mg/mL。將超臨界CO2萃取物（50 g）用于硅膠柱，使用石油醚（沸點60～90℃）和乙酸乙酯（30∶1→1∶1，V/V）進行分離。首先制備色譜柱：稱取硅膠40 g，將硅膠與洗脫劑按比例混合（20∶1），攪拌除去空氣泡，徐徐傾入色譜柱中，不能留有氣泡，然后加入石油醚將附著在管壁的硅膠洗下，使色譜柱面平整，平衡1 h后加入供試品進行洗脫。將萃取物溶于石油醚中，沿著色譜柱管壁緩慢加入，當液面下降至與柱表面相平時，即從色譜柱頂端緩慢加入洗脫劑石油醚。將洗脫劑石油醚沿管壁緩慢加入，打開底閥，緩慢滴加，控制流速為l mL/min，當流過色譜柱的一個空體積后即用標號的試劑瓶開始收集，得到化合物4（6 mg）、化合物3（2 mg）、化合物5（50 mg）、化合物6（4 mg）、化合物1（10 mg）和化合物2（13 mg）。采用紫外光譜、質譜分析、1H和13C核磁共振光譜鑒定，上述化合物分別為蒼術內酯Ⅰ（10 mg）、蒼術內酯Ⅲ（13 mg）、蒼術醇（2 mg）、α-姜黃烯（6 mg）、蒼術酮（50 mg）、蒼術呋喃烴（4 mg），得到蒼術酮，低溫（-18℃）、避光保存，備用。

1.2 試劑與儀器流感A/PR/8/34病毒（H1N1亞型）和A/深圳/203/2001（H3N2亞型）由浙江省疾病預防控制中心（中國浙江省）保存。血清IFN-β白細介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自Biovol技術公司。Trizol裂解和提取試劑盒購自上海Biotechnology公司。cDNA合成試劑盒購自大連Takara公司。BCA試劑盒購自碧云天生物公司。NF-κB p65抗體和βactin抗體購自康成生物。Odyssey IRDye 680 conjugated山羊抗兔IgG、Odyssey Blocking Buffer均產自美國Li-Cor公司。Nonidet P40產于美國SIGMAALDRICH公司，PMSF購自美國Fluka公司。完全性蛋白酶抑制劑混合物為德國Roche公司產品；40％ Acrylamide/bis Solution［N，N’-Methylenbis-acrylamid，Mix，Ratio 37.5∶1（2.6％C）］和Tween-20購自美國Bio-Rad公司。預染蛋白標準品產于加拿大Fermentas公司。硝酸纖維薄膜、甘氨酸、Tris、TEMED、EDTA、SDS為美國Amresco產品。異丙醇、溴酚藍購自上海試劑三廠。過硫酸銨、甲醇、濃鹽酸均為分析純，購自中國國藥集團化學試劑有限公司。Odyssey紅外掃描系統(tǒng)為Li-Cor公司產品。

1.3 造模與給藥將144只雄性SPF級ICR小鼠隨機分為正常組24只，模型組120只。模型組在乙醚麻醉下通過鼻內接種IAV誘導感染，這種病毒在小鼠中引起肺炎，然后隨機平均分為5組，每組24只，分別為模型組，利巴韋林組，蒼術酮低、中、高劑量治療組。在造模2 h后，蒼術酮治療組分別給予低、中、高劑量為10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg，利巴韋林組給予50 mg/kg采用灌胃給藥，每日1次，共5 d。模型組以及正常組小鼠，在相同的時間間隔給予0.9％氯化鈉注射液。

1.4 采集與檢測1）血清炎癥細胞因子檢測。經過5 d的治療，測定動物體質量后處死動物。采集血標本，離心3000×g共20 min分離血清，儲存于4℃待檢。血清IFN-β、IL-6、TNF-α、IL-1β采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測。2）肺組織TLR7信號通路蛋白的測定。小鼠肺組織采用Trizol試劑進行勻漿和提取總RNA（Biotechnology Co.Ltd.）。根據(jù)試劑盒提供的操作說明，合成cDNA（Takara公司）。本研究使用的特異性引物（TLR-7、MyD88、TRAF6、IFN-β和18sRNA）見表1，由上海生工公司合成。選擇真核細胞的18S rRNA作為研究對象的看家基因。擴增反應體系含有2 μL cDNA、0.5 μL正向和反向引物（終濃度每0.5μM）、12.5 μL 2×SYBR Green，無核酸酶的水，反應體積為25 μL。擴增反應的條件為：95℃1 min，然后40個循環(huán)，95℃變性10 s，55℃退火25 s，64℃延長25 s，然后64℃延長25 s采集熒光數(shù)據(jù)。使用2-ΔCt×106方法計算基因的相對表達水平［4］。3）Western blot檢測［5-6］。采用RIPA試劑分離肺組織總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠中蛋白電轉移至硝酸纖維素膜上，加Odyssey blocking buffer封閉，加入1抗（NF-κB p65，工作濃度1∶1000），4℃下?lián)u床振蕩過夜，洗滌后加入2抗反應。洗滌后將膜置于Odyssey儀器上掃描、分析，使用內參照β-actin校正目標蛋白表達量。

表1 RFQ-PCR檢測引物序列

1.5 統(tǒng)計學處理應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多樣本均數(shù)間比較使用ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血清細胞因子水平比較見表2。與正常組比較，模型組小鼠血清中IFN-β、IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著升高（P＜0.01）。與模型對照組比較，利巴韋林組和蒼術酮各組IL-6、TNF-α、IL-1β炎癥因子水平均顯著下降，而IFN-β水平顯著升高（P＜0.01）。蒼術酮高、低劑量組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠血清細胞因子水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠血清細胞因子水平比較（pg/mL，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別n正常組24模型對照組24利巴韋林組24 IFN-βIL-6TNF-αIL-1β 22.9±2.7513.6±1.21**8.64±1.09**9.15±0.38**24.5±2.5229.8±2.6618.9±1.3721.3±2.06 23.3±2.7918.5±5.99**13.4±1.54**21.6±3.36蒼術酮高劑量組2430.8±3.31**12.8±1.16**9.20±0.77**13.4±0.74**蒼術酮中劑量組2429.4±3.27*17.4±1.11**11.8±1.94**16.5±1.17**蒼術酮低劑量組2425.8±2.8719.5±2.76**16.2±2.27*17.2±1.35**

2.2 各組小鼠肺組織TLR7信號通路蛋白的表達水平見表3，表4，圖1。與模型組相比，蒼術酮各組TLR7及其下游基因MyD88，TRAF6和IFN-β的mRNA表達顯著上調（P＜0.01），這表明上述途徑被激活。此外，Western印跡分析結果顯示，模型組的核因子κB（NF-κB）p65蛋白表達水平較正常組顯著增加（P＜0.01）；

表3 各組小鼠肺組織中TRL7、MyD88、TRAF6和IFN-β mRNA表達水平比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織中TRL7、MyD88、TRAF6和IFN-β mRNA表達水平比較（±s）

組別n正常組24模型對照組24利巴韋林組24 TLR7表達量MyD88表達量TRAF6表達量IFN-β表達量1.00±0.02**1.00±0.001.00±0.01**1.00±0.01**1.49±0.221.01±0.202.01±0.141.72±0.19 1.61±0.50*0.96±0.281.93±0.241.55±0.25蒼術酮高劑量組244.18±0.99**2.02±0.52**2.63±0.49**3.49±0.51**蒼術酮中劑量組243.89±0.74**1.88±0.49**2.37±0.38**3.01±0.50**蒼術酮低劑量組242.61±0.50**1.79±0.45**2.18±0.30*2.19±0.43**

表4 各組小鼠NF-κB p65蛋白表達水平比較（±s）

表4 各組小鼠NF-κB p65蛋白表達水平比較（±s）

蒼術酮對急性肺損傷小鼠組織TLR7信號通路的調節(jié)作用（表3）。RFQ-PCR檢測TLR7、MyD88、TRAF6和IFN-β mRNA表達水平（圖4，圖1）。Western bolt檢測NF-κB p65（依次為正常對照組、模型對照組、利巴韋林組、蒼術酮低、中、高治療組），檢測值采用內參照（18S rRNA或者β-actin）進行校正。

圖1蒼術酮對急性肺損傷小鼠肺組織TLR7信號通路的調節(jié)作用與模型組相比，利巴韋林組及蒼術酮各治療組的蛋白表達顯著減少（P＜0.01）。

3 討論

ALI是機體釋放出大量炎癥介質的同時，還能釋放出大量的抗炎癥介質，如果炎癥介質和抗炎癥介質失調，就會導致機體內環(huán)境失去穩(wěn)定，造成機體器官損害［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，蒼術酮顯著增加IFN-β的水平，而降低其他促炎性細胞因子的水平（IL-6、TNF-α和IL-1β）?；驒z測結果發(fā)現(xiàn)TLR7及其下游MyD88、TRAF6和IFN-β基因表達顯著上調，這表明上述信號途徑被激活。Western blot分析結果顯示，蒼術酮治療后，TLR7下游因子中最重要的炎癥蛋白NF-κB p65蛋白表達明顯減少。

TNF-α、IL-6、IL-1β是ALI早期的炎癥因子，可加劇炎癥細胞的浸潤和黏附，并刺激巨噬細胞釋放更多的促炎因子［8-10］。干擾素具有抗流感病毒的作用，正常情況下，機體干擾素水平較低，當有病毒入侵后啟動干擾素調控基因的表達，生成多種蛋白質和酶作用于病毒，起到抗病毒作用［11-12］。本研究結果表明，在正常小鼠感染病毒后，干擾素-β水平呈現(xiàn)上升趨勢，在蒼術酮干預后，其血清水平明顯升高，說明蒼術酮抗病毒作用與提高IFN-β水平有關。Toll受體家族是一類介導細胞固有免疫的細胞膜受體家族，可以識別多種病原體，并通過不同的信號通路啟動固有免疫反應，病毒入侵后可促進免疫基因的表達，在抗病毒免疫反應、致病機制、疫苗和藥物研究中有非常重要的意義［13］。TLR7作為Toll受體家族的成員之一，在機體許多組織中廣泛表達，在抵御病原體入侵過程中發(fā)揮重要作用［14］。TLR7的信息轉導與MyD88依賴性和非MyD88依賴性都有關，2條途徑均可促進干擾素的活化和釋放。MyD88分子是TLR7信號轉導中的接頭分子，活化后的MyD88可促進腫瘤壞死因子受體相關因子-6（TRAF-6）的活化，TRAF-6在細胞內與下游分子相互作用，最終引起NF-κB的活化來誘導細胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的表達，參與免疫與炎癥反應［12，15-17］。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)在甲型流感病毒誘導的小鼠ALI中NF-κB廣泛表達。應用蒼術酮干預后，NF-κB的表達明顯減少。由此可推斷蒼術酮對ALI的治療作用可能是通過增強TLR7、MyD88、TRAF-6和IFN-β mRNA的表達，抑制核因子NF-κB p65蛋白表達，進而減輕肺部炎癥反應。

綜上所述，蒼術酮能夠明顯減輕ALI小鼠的肺部炎癥，其作用依賴于TLR7信號通路的激活，誘導I型干擾素的產生和對NF-κB p65表達的抑制，可用于制備治療的有效藥物，具有良好的應用前景和應用價值。

［1］Sadowitz B，Roy S，Gatto LA，et al.Lung injury induced by sepsis：lessons learned from large animal models and future directions for treatment［J］.Expert Review of Anticancer Therapy，2011，9（12）：1169-1178.

［2］魏東，劉英，賈寧，等.H9N2亞型豬流感病毒誘導小鼠急性肺損傷中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的變化和作用［J］.中國實驗動物學報，2013，21（2）：72-74.

［3］石書江，秦臻，孔松芝，等.蒼術抗流感病毒有效成分的篩選［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（3）：565-566.

［4］Cheng Y，Mai JY，Wang MF，et al.Antifibrotic effect of total flavonoids of Astmgali Radix on dimethylnitrosamine-induced liver cirrhosis in rats［J］.Chin J Integr Med，2017，23（1）：48-54.

［5］Cheng Y，Mai J，Hou T，et al.MicroRNA-421 induces hepatic mitochondrial dysfunction in non-alcoholic fatty liver disease mice by inhibiting sirtuin 3［J］.Biochemical&Biophysical Research Communications，2016，474（1）：57-63.

［6］Cheng Y，Hou T，Ping J，et al.Quantitative succinylome analysis in the liver of non-alcoholic fatty liver disease rat model［J］.Proteome science，2016，14（1）：1-11.

［7］關嵐，涂家紅，李天水，等.白細胞介素在急性肺損傷大鼠中的作用［J］.中國急救復蘇與災害醫(yī)學雜志，2008，3（12）：728-730.

［8］潘永利.黃芩苷對急性肺損傷大鼠的保護作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（3）：238-240.

［9］肖燕，崔社懷，沈渝菊，等.急性肺損傷發(fā)病過程中IL-6與肺表面活性蛋白SP-A、SP-B的關系研究［J］.軍事醫(yī)學，2008，32（3）：261-263.

［10］Dou W，Zhang J，Sun A，et al．Protective effect of naringenin against experimental colitis via suppression of Toll-like receptor 4/NF-κB signalling［J］．Br J Nutr，2013，110（4）：599-608．

［11］Diebold SS，Kaisho T，Hemmi H，et al.Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of singlestranded RNA［J］.Science，2004，303（5663）：1529-1531.

［12］劉蓉，茍玲，于柳，等.桂枝揮發(fā)油與桂皮醛對病毒性肺炎小鼠死亡保護作用及TLR/IFN信號機制研究［J］.中藥藥理與臨床，2013，29（4）：33-36.

［13］楊永峰，申煥君，姜泓，等.Toll樣受體4介導的抗病毒固有免疫研究進展［J］.細胞與分子免疫學雜志，2016，32（6）：854-858.

［14］王曉月，趙鵬翔，馬雪梅.Toll樣受體7的研究進展［J］.細胞與分子免疫學雜志，2016，32（9）：1267-1271.

［15］羅兵，李濤，徐元宏.Toll樣受體的信號轉導及抗感染免疫研究進展［J］.免疫學雜志，2011，27（2）：165-169.

［16］李影，陳鏡宇，張玲玲，等.腫瘤壞死因子受體相關因子參與炎癥免疫調節(jié)的研究進展［J］.中國藥理學通報，2015，31（9）：1206-1211.

［17］張艱，李圣青，李煥章，等.NF-κB在大鼠急性肺損傷模型肺組織中的表達及N-乙酰半胱氨酸的影響［J］.細胞與分子免疫學雜志，2004，20（6）：712-715.

Effect of Atractylon on Serum Cytokines and TLR7 Signaling Pathway in Mice with Acute Lung Injury

CHEN Tianyang，XUE Jianhua，HOU Tianlu，et al.Infectious Disease Hospital of Pudong，Shanghai 201299，China.

Objective：To observe the effect of atractylon on serum cytokines and TRL7 signaling pathway in mice with acute lung injury.Methods：The acute lung injury model of mice was induced by infecting influenza A virus in the respiratory tract.A total of 144 male SPF grade ICR mice were randomly divided into the normal control group（n=24）and the model group（n=120）.In the model group，IAV was induced by intranasal administration under ether anesthesia.This virus caused pneumonia in mice，and then the mice were randomly divided into 5 groups，24 rats in each：the control group，the ribavirin treatment group，atractylon low dose，middle dose and high dose treatment groups.The positive drug group was treated with 50 mg/kg of ribavirin，and the atractylon of low，medium and high dose treatment groups were given 10 mg/kg，20 mg/kg，40 mg/kg intragastric administration，once per day，for 5 days.After 5 days，the animals were killed and the serum and lung tissue samples were collected.The levels of IFN-β，IL-6，TNF-α and IL-1β in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expression of TLR-7，MyD88，TRAF6 and IFN-β mRNA in lung tissue of mice was determined by PCR.The expression of NF-κB p65 protein was detected by Western blot.Results：Compared withthe normal group，the levels of IFN-β，IL-6，TNF-α and IL-1β in the serum of the model group were significantly increased（P＜0.01）.Compared with the model group，the level of IL-6，TNF-α and IL-1βin the ribavirin group and the atractylon group decreased significantly，while IFN-β level increased significantly（P＜0.01）.There was significant difference between high and low dose groups（P＜0.05）.Compared with model control group，the mRNA expression of TLR7 and its downstream genes MyD88，TRAF6 and IFN-β were significantly up-regulated（P＜0.01）.In addition，Western blot analysis showed that the expression level of NF-κB p65 protein in model control group was significantly higher than that in normal control group（P＜0.01）.Compared with model group，the protein expression of the group was significantly decreased（P＜0.01）.Conclusion：Atractylon can significantly relieve lung inflammation in mice with acute lung injury.The mechanism depends on the activation of TLR7 signaling pathway，the production of type I interferon and the inhibition of NF-κB p65 expression.

Atractylon；Acute lung injury；Cytokines；TRL7

R285.5

A

1004-745X（2017）06-0952-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.06.004

2016-12-18）

上海市中醫(yī)藥三年行動計劃項目（ZY3-JSFC-1-1011）；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)領先人才項目（PWRL2016-01）；上海市中醫(yī)藥領軍人才學術共同體項目（ZY3-RCPY-1-1001）；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年醫(yī)學人才培養(yǎng)計劃（PWRq2016-01）

△通信作者（電子郵箱：drchengyang@126.com）