參附注射液預(yù)處理改善大鼠急性腦梗死后氧化應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究*

陳 靜 冷 靜

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

·研究報(bào)告·

參附注射液預(yù)處理改善大鼠急性腦梗死后氧化應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究*

陳 靜 冷 靜△

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

目的 觀察不同劑量參附注射液抑制氧化應(yīng)激的作用，探求不同劑量參附注射液改善大鼠腦梗死后氧化應(yīng)激的潛在機(jī)制。方法 選取70只雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組和參附注射液組（高、中、低劑量）。除空白組外，模型組和參附注射液組采用線栓法制作大鼠腦梗死模型，假手術(shù)組僅進(jìn)行手術(shù)不造模。最終選取手術(shù)和造模成功的大鼠入組，每組10只。采用伊文思藍(lán)法檢測(cè)血腦屏障通透性，給予不同劑量參附注射液干預(yù)，測(cè)定大鼠血清中總超氧化物歧化酶（SOD）、銅鋅-超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活性，血液過氧化氫（H2O2）水平差異，并與空白組比較。結(jié)果 模型組組伊文思藍(lán)含量明顯高于空白組和假手術(shù)組，同時(shí)模型組血清中SOD、CuZn-SOD和H2O2表達(dá)升高（P＜0.01）。不同劑量參附注射液干預(yù)組伊文思藍(lán)均較模型組下降（P＜0.01），SOD、CuZn-SOD和H2O2表達(dá)下降（P＜0.01），尤其以高劑量參附注射液干預(yù)組更明顯。結(jié)論 參附注射液減少急性腦梗死后氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能通過降低血腦屏障通透性，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、恢復(fù)神經(jīng)功能發(fā)揮作用，并呈劑量依賴。

參附注射液 腦梗死 氧化應(yīng)激 血腦屏障

腦梗死后神經(jīng)細(xì)胞因缺血導(dǎo)致缺氧，神經(jīng)細(xì)胞幾分鐘內(nèi)發(fā)生不可逆性損傷甚至死亡。死亡的大腦細(xì)胞無法再生，造成永久性的后果。腦梗死后，機(jī)體的神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)代謝失常，破壞血腦屏障，導(dǎo)致大腦的血腦屏障通透性增加，從而引起腦水腫的形成?，F(xiàn)代研究表明，血腦屏障的破壞可導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，增加大腦組織的損傷。臨床治療及基礎(chǔ)研究顯示，參附注射液對(duì)此類損傷具有良好的治療和康復(fù)作用，能夠減少神經(jīng)細(xì)胞在此類疾病中的損傷，增加其缺氧耐受能力［1-4］。本實(shí)驗(yàn)通過使用參附注射液預(yù)處理大鼠，進(jìn)而觀察干預(yù)后大鼠急性腦梗死模型的改變以及通過藥物抑制急性腦梗死后血腦屏障通透性的改變、多種氧化應(yīng)激指標(biāo)的表達(dá)，從而探討參附注射液改善腦梗死后腦功能的機(jī)制，為臨床應(yīng)用參附注射液早期預(yù)防腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性SD大鼠70只，SPF級(jí) ［由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)：SCXK（渝）2012-0006，動(dòng)物合格證號(hào)：0001507］。實(shí)驗(yàn)環(huán)境符合國家大鼠屏障系統(tǒng)（SPF級(jí)）使用設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物飼養(yǎng)于空調(diào)室內(nèi)，室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度（60± 5）%，飼喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和攝食。

1.2 藥物與試劑 參附注射液（購于雅安三九藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z51020664，產(chǎn)品批號(hào)11120913），黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清、腦組織超氧化物歧化酶（SOD）及銅鋅-超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）活性試劑盒、比色法測(cè)定血清過氧化氫（H2O2）含量試劑盒、大鼠細(xì)胞因子白介素-6（IL-6）ELISA檢測(cè)試劑盒，以上試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司。

1.3 造模及分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將70只Wistar大鼠分為空白組、模型組、假手術(shù)組、參附注射液高劑量組［40 mg/（kg·d）］、參附注射液中劑量組［20 mg/（kg·d）］、參附注射液低劑量組［10 mg/（kg·d）］6組，各10只，另外10只大鼠為造模和手術(shù)損失進(jìn)行補(bǔ)充，最終手術(shù)和造模成功動(dòng)物入組。所有藥物經(jīng)灌飼法喂給，共預(yù)處理4周。模型組大鼠給予同體積比的0.9%氯化鈉溶液。采用大腦中動(dòng)脈線栓法制作局灶性腦缺血模型，將大鼠用體積分?jǐn)?shù)2%水合氯醛麻醉后，切開大鼠的頸中部皮膚，分離頸總動(dòng)脈，然后再分離出頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，用尼龍魚線從頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端切口插入頸內(nèi)動(dòng)脈20 mm，阻塞大腦中動(dòng)脈近端血流。假手術(shù)組僅進(jìn)行相同部位切開手術(shù)，不進(jìn)行造模處理。

1.4 觀察指標(biāo) 參考相關(guān)文獻(xiàn)［2-3］進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為1～3分。伊文思藍(lán)測(cè)定大鼠通透性變化，在腦梗死24 h后大鼠尾部靜脈注射體積分?jǐn)?shù)2%伊文思藍(lán)。0.5 h后麻醉大鼠，用肝素生理鹽水灌流心臟，直至右心房有清澈液體后斷頭，取出腦組織后浸入甲酰胺置于60℃水浴箱中孵育1 d，用分光光度計(jì)檢測(cè)波長為600 nm，制定伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析腦組織中伊文思藍(lán)含量。腦組織內(nèi)IL-6含量的測(cè)定，留取大腦標(biāo)本，-80℃保存。冰浴快速勻漿提取蛋白質(zhì)，-20℃保存。以改良的Lowry法測(cè)定蛋白。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示。各觀察指標(biāo)的組間比較，在滿足方差齊性和正態(tài)分布時(shí)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦缺血24 h后伊文思藍(lán)含量比較 空白組，模型組，假手術(shù)組，參附注射液高、中、低劑量組大鼠腦缺血24 h后伊文思藍(lán)含量分別為（1.0±0.21）μg/g、（6.5±1.94）μg/g、（1.1±0.29）μg/g、（2.1±0.37）μg/g、（2.9±0.35）μg/g、（3.4±0.47）μg/g。模型組大鼠腦缺血24 h后伊文思藍(lán)含量明顯高于空白組和假手術(shù)組，參附注射液高、中、低劑量組與模型組比較則明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 各組大鼠腦組織IL-6含量的比較 見表1。模型組與空白組相比，梗死區(qū)及非梗死區(qū)IL-6含量均升高（P＜0.01），尤其以非梗死區(qū)升高更明顯；與模型組相比，參附注射液高、中、低劑量組梗死區(qū)IL-6含量無明顯下降（P＞0.05），非梗死區(qū)IL-6含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠腦組織IL-6含量比較（pg/mL，±s）

表1 各組大鼠腦組織IL-6含量比較（pg/mL，±s）

與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n 梗死區(qū)IL-6含量非梗死區(qū)IL-6含量空白組 10 — 96.00±25.34模型組 10 105.00±27.26*204.00±48.56**假手術(shù)組 10 — 103.45±24.16參附注射液高劑量組 10 109.00±24.45 158.00±34.23△△參附注射液中劑量組 10 114.00±23.73 173.00±29.13△參附注射液低劑量組 10 119.00±26.33 188.00±24.27△

2.3 各組大鼠血清和腦組織SOD、CuZn-SOD活性及血清H2O2含量比較 見表2。腦梗死后，模型組大鼠各指標(biāo)與空白組比較明顯改變（P＜0.01）。與模型組相比，參附注射液組各劑量組SOD、CuZn-SOD活性顯著升高，腦內(nèi)H2O2含量顯著降低。顯示經(jīng)參附注射液預(yù)處理，可顯著改善由腦梗死所引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清和腦組織SOD、CuZn-SOD活性及血清H2O2含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清和腦組織SOD、CuZn-SOD活性及血清H2O2含量比較（±s）

組別 n 血清SOD（U/mL）空白組 10 348.00±39.67模型組 10 207.00±22.29**假手術(shù)組 10 339.00±32.77參附注射液高劑量組 10 306.00±93.36△△參附注射液中劑量組 10 297.00±21.44△參附注射液低劑量組 10 278.00±33.69△CuZn-SOD（U/mL）血清H2O2（mmol/L）236.00±55.34 86.00±20.17 154.00±58.19**157.00±55.20**231.00±46.25 84.00±19.36 200.00±39.17△△96.00±15.27△△186.00±34.11△106.00±26.37△171.00±39.49△119.00±26.31△

3 討 論

隨著中國人口的老齡化進(jìn)程的加深，腦梗死疾患發(fā)病率正逐漸增高，此病是致殘、致死的主要病因之一，導(dǎo)致患者不同程度地喪失勞動(dòng)能力以及生活自理能力，給國家、社會(huì)、家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此，醫(yī)學(xué)界一直在尋找有效的防治方法，以期對(duì)其進(jìn)行早期干預(yù)處理。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液除具有降脂的作用之外，還具有抗炎、抗血栓、穩(wěn)定斑塊、延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程等作用，對(duì)心腦血管起到多方面的保護(hù)作用［2-3］。

急性腦梗死后交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活致AngⅡ水平升高，腦梗死后細(xì)胞壞死等異常應(yīng)激也導(dǎo)致IL-6等細(xì)胞因子分泌增多。IL-6也可介導(dǎo)炎癥及免疫反應(yīng)，在斑塊破裂而引起的急性腦梗死這一環(huán)節(jié)中起了關(guān)鍵的作用［5-6］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，參附注射液藥物神經(jīng)組織和細(xì)胞的保護(hù)作用可能通過降低IL-6等細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)。同時(shí)它也通過抑制異常的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)，降低血管的通透性，維持血腦屏障正常生理功能發(fā)揮對(duì)腦組織結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用。

參附注射液具有抗炎、改善內(nèi)皮功能、抑制纖維蛋白的產(chǎn)生和血栓形成，對(duì)于腦梗死具有重要的保護(hù)作用。有研究表明該藥物能夠改善內(nèi)皮功能，增加NO的釋放，提高心肌內(nèi)皮型NOS（e-NOS）的活性，這些功能可能延緩或阻止動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程［7］。有學(xué)者報(bào)道，參附注射液類藥物可以阻斷包括下調(diào)RhoA的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑，抑制血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的交感異常應(yīng)激［8-9］。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)參附注射液類藥物也可能抑制不穩(wěn)定斑塊的炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定血腦屏障等。也有研究證實(shí)不同劑量參附注射液可以改善腦梗死大鼠的血腦屏障［10-15］。本實(shí)驗(yàn)與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，不同劑量參附注射液干預(yù)可降低腦梗死后腦組織非梗死區(qū)IL-6的表達(dá)水平，抑制腦梗死后血腦屏障通透性的異常增高，改善腦水腫，增加SOD、CuZn-SOD水平，減少H2O2，通過抗氧化的作用，從而改善腦梗死患者的預(yù)后。本研究為在腦梗死的疾病早期使用大劑量的參附注射液，以干預(yù)病情的進(jìn)展，減少其急慢性并發(fā)癥，改善腦梗死患者的預(yù)后等方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可供臨床作為參考，然其深入機(jī)制尚需進(jìn)一步研究探討。

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Experimental Study of Simvastatin Preconditioning on Oxidative Stress in Rats with Acute Cerebral In-farction

CHEN Jing，LENG Jing. Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chongqing 400021，China.

Objective：To observe the effect of different doses of Simvastatin on the inhibition of oxidative stress，and to explore the potential mechanism of different doses of Simvastatin in improving the oxidative stress in rats with cerebral infarction.Methods：70 male Wistar rats were randomly divided into the blank group，the sham operation group，the model group and the simvastatin groups（high，medium and low dose）.In the model group and simvastatin groups，the cerebral infarction model was made with suture method；the sham operation group was only operated without modeling.Finally，the rats with successful operation or modeling were selected into the groups，10 rats in each group.Evans blue method was used to detect blood-brain barrier permeability；given different doses of simvastatin intervention，total superoxide dismutase（SOD）in rat serum was determined，as well as copper and zinc-superoxide dismutase（CuZn-SOD）activity，and blood hydrogen peroxide（H2O2）differences，and all of the data was compared with that of the blank group.Results：The content of Evans blue in the model group was significantly higher than that in the blank group and the sham operation group.Besides，SOD，CuZn-SOD and H2O2expression in serum increased in the model group（P＜0.01）.Evans blue in different doses of simvastatin intervention groups declined，compared with that in the model group（P＜0.01）；SOD，CuZn-SOD and H2O2expression decreased（P＜0.01），especially in high dose group.Conclusion：Simvastatin can decrease the expression of oxidative stress in patients with acute cerebral infarction，which may be one of the mechanisms to reduce the blood-brain barrier permeability，protect the nerve cells and restore the function of the nervous system，and has a certain correlation with the dose.

Simvastatin injection；Cerebral infarction；Oxidative stress；Blood-brain barrier

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： 文章編號(hào)：1004-745X（2017）05-0761-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.003

2017-02-23）

重慶市社會(huì)事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項(xiàng)（cstc2016shms-zd0015）

△通信作者（電子郵箱：54408193@qq.com）