骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)光氣吸入性肺損傷大鼠肺組織及血漿炎癥因子的干預(yù)作用

閔思慶， 何岱昆， 鐘志越， 陳俊峰， 申 捷

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，上海 201508

·短篇論著·

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)光氣吸入性肺損傷大鼠肺組織及血漿炎癥因子的干預(yù)作用

閔思慶， 何岱昆， 鐘志越*， 陳俊峰， 申 捷

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，上海 201508

目的： 觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMD-MSCs)移植對(duì)光氣吸入性肺損傷大鼠肺組織及血漿炎癥因子的干預(yù)作用。方法： 96只雄性SD大鼠隨機(jī)分為：空氣對(duì)照組(A組)、BMD-MSCs干預(yù)對(duì)照組(AM組)、光氣染毒組(PH組)、光氣染毒后BMD-MSCs 干預(yù)組(PM組)，每組8只。染毒組按8.33 mg/L動(dòng)態(tài)恒量染毒5 min。PM組染毒后即刻經(jīng)尾靜脈注射106BMD-MSCs。4組分別于模型完成后6、24、48 h處死大鼠，取肺組織行病理檢查及肺濕/干比、血?dú)夥治觯⊙獫{行Bio-Plex細(xì)胞因子檢測(cè)。結(jié)果： PH組較A組TNF-α濃度明顯升高(P<0.05)；PM組較PH組TNF-α濃度降低(P<0.05)。PM組與PH組血漿IL-4濃度6 h、24 h均降低，以PM組下降更明顯(P<0.05)；48 h明顯升高，以PM組升高更明顯(P<0.05)。PH組較A組IL-10濃度高(P<0.05)；PM組較PH組IL-10濃度高(P=0.013)。結(jié)論： 經(jīng)尾靜脈注射BMD-MSCs后可以使大鼠血漿中抗炎因子IL-4和IL-10逐漸升高，促炎因子TNF-α逐漸下降，提示其對(duì)光氣致急性肺損傷大鼠肺具有保護(hù)作用。

光氣；急性肺損傷；細(xì)胞因子；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

急性肺損傷目前缺乏有效的的治療方法。盡管近年來通過呼吸支持系統(tǒng)治療急性肺損傷取得了一些進(jìn)步，但是由不同病因引起的急性肺損傷患者的死亡率仍約占40%[1]。因此有必要研究治療急性肺損傷的有效方法。

光氣一種具有強(qiáng)烈毒性的化學(xué)物質(zhì)。光氣中毒會(huì)導(dǎo)致急性肺損傷，其易發(fā)展為難治性肺水腫，甚至引起死亡。目前，光氣導(dǎo)致人體中毒的機(jī)制尚不明確。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)研究急性肺損傷中TNF-α、IL-4、IL-10等細(xì)胞因子的變化較為關(guān)注[2]，但有關(guān)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMD-MSCs)移植對(duì)急性肺損傷中促炎因子與抗炎因子影響的研究較少。因此，本研究通過探索多種細(xì)胞因子在光氣吸入性肺損傷中及用BMD-MSCs干預(yù)后的變化，以期發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子在急性肺損傷中的變化規(guī)律及相互作用，并分析BMD-MSCs移植對(duì)急性肺損傷的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 無血清低糖DMEM、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司。固體三光氣購(gòu)自浙江海寧中聯(lián)化學(xué)有限公司，N，N-二甲基甲酰胺、環(huán)己烷購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。動(dòng)態(tài)恒量染毒柜購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)，Bio-Plex 200 System高通量蛋白懸浮芯片分析系統(tǒng)及蛋白懸浮芯片試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。其他用于本研究的生化試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)純化，具體操作參照說明書。

1.2 實(shí)驗(yàn)大鼠分組及處理 SPF級(jí)雄性SD大鼠96只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。將大鼠隨機(jī)分為4組：空氣對(duì)照組(A組)、BMD-MSCs干預(yù)對(duì)照組(AM組)、光氣染毒組(PH組)、殺毒后BMD-MSCs干預(yù)組(PM組)，每組24只。A組大鼠吸入空氣，經(jīng)尾靜脈注射PBS；AM組吸入空氣，經(jīng)尾靜脈注射106BMD-MSCs；PH組進(jìn)行光氣染毒，經(jīng)尾靜脈注射PBS；PM組光氣染毒后，經(jīng)尾靜脈注射106BMD-MSCs。染毒方法[3]：將大鼠置于動(dòng)態(tài)恒量染毒柜中，通入濃度為8.33 mg/L的光氣(由固體三光氣完全溶解于環(huán)己烷后，與N，N-二甲基甲酰胺反應(yīng)生成)，染毒5 min。

所有大鼠模型建立后正常進(jìn)食水。分別于A組吸入空氣，AM組注射BMD-MSCs，PH組染毒、PM組注射BMD-MSCs后6、24、48 h各處死8只大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血。全血經(jīng)800×g4℃離心5 min，取血漿-20℃保存待檢。取大鼠肺組織初步處理后待檢。

1.3 大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)培養(yǎng)及鑒定 采用貼壁法分離培養(yǎng)MSCs，方法簡(jiǎn)述如下：將大鼠斷頸處死后，無菌分離股骨和脛骨；用注射器將骨髓從骨髓腔內(nèi)沖出，收集懸液后離心沉淀；用無血清低糖DMEM洗滌沉淀2次后，加入含20%胎牛血清的低糖DMEM，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞的表型用流式細(xì)胞儀鑒定。收集4～5代細(xì)胞用于急性肺損傷的治療。

1.4 BMD-MSCs移植 在分離培養(yǎng)5代的BMD-MSCs細(xì)胞中加入攜帶GFP的腺病毒，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h(轉(zhuǎn)染率約60%)。大鼠經(jīng)光氣暴露染毒成功后，立即經(jīng)尾靜脈注射106BMD-MSCs細(xì)胞。轉(zhuǎn)染率=暗視野所見發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/明視野所見細(xì)胞數(shù)。每個(gè)標(biāo)本任取3個(gè)高倍鏡視野。

1.5 肺濕/干比分析及病理檢查 將新鮮分離的肺組織經(jīng)PBS洗滌去除殘留血塊后稱質(zhì)量，計(jì)作濕質(zhì)量；將肺組織經(jīng)80℃烤箱烘烤至恒重再次稱質(zhì)量，計(jì)作干質(zhì)量。兩者的比值即為干濕比。

取右肺上葉置于10%甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋制成5 μm厚的組織切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(H-E)染色后，于顯微鏡下觀察，分析大鼠肺組織的病理改變，以判斷肺損傷及肺水腫程度。

1.6 Bio-Plex高通量蛋白懸浮芯片細(xì)胞因子檢測(cè) 檢測(cè)大鼠血漿中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、IL-10。所有血漿樣品檢測(cè)前4℃水浴解凍，560×g4℃離心10 min，取上清待檢。按說明書準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)樣品、微珠、檢測(cè)抗體及Streptavidin-PE熒光色素，以100 μL Bio-Plex Assay緩沖液濕潤(rùn)濾板，真空吸板機(jī)吸凈后，每孔加入微珠混懸液50 μL并吸凈PBS，每孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50 μL、抗體25 μL、Streptavidin-PE熒光色素溶液50 μL后室溫?fù)u床10 min。真空吸板機(jī)吸凈濾板并用PBS清洗3次，然后用PBS 125 μL重懸微珠，560×g4℃離心10 min室溫?fù)u床30 s后放入儀器中檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 病理檢查結(jié)果 H-E染色(圖1)顯示：同一時(shí)間點(diǎn)PH組大鼠肺組織出血點(diǎn)較其他3組明顯增多，PM組較其他3組明顯減少。A組與AM組肺泡結(jié)構(gòu)完整，無明顯滲出；PH組染毒6 h及24 h肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)大量紅細(xì)胞；PM組較PH組肺泡結(jié)構(gòu)改善。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺組織H-E染色結(jié)果

2.2 肺濕/干比 PH組與PM組肺濕/干比明顯高于A組與AM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PM組肺濕/干比低于PH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。PH組及PM組染毒后6、24、48 h肺濕/干比呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺濕/干比 n=8，

*P<0.05與A組相比;△P<0.05與AM組相比;▲P<0.05與PH組相比

2.3 血氧分壓(PaO2) PH組及PM組PaO2低于A組及AM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PM組PaO2大于PH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)；PH組和PM組染毒后6、24、48 h PaO2逐漸回升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PaO2 p/mmHg； n=8，

1 mmHg=0.133 kPa.*P<0.05與A組相比;△P<0.05與AM組相比;▲P<0.05與PH組相比

2.4 Bio-Plex高通量蛋白懸浮芯片細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 PH組大鼠血漿TNF-α值較A組和AM組升高，隨時(shí)間推移逐漸下降，但仍高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PH組血漿IL-4濃度在染毒后6、24 h降低，48 h時(shí)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PH組血漿IL-10濃度在染毒后6 h時(shí)升高，隨時(shí)間推移逐漸下降，但仍高于A組(P=0.02)。PM組TNF-α在BMD-MSCs移植后6、24 h與PH組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，48 h時(shí)下降(P=0.013)；PM組血漿IL-4濃度BMD-MSCs移植后呈上升趨勢(shì)，48 h時(shí)高于PH組(P=0.009)；PM組血漿IL-10在BMD-MSCs移植后呈下降趨勢(shì)，但在6、24、48 h時(shí)檢測(cè)值均高于PH組(P<0.05，表3～表5)。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α檢測(cè)結(jié)果 ρB/(pg·mL-1)； n=8，

*P<0.05與A組相比;△P<0.05與AM組相比;▲P<0.05與PH組相比

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-4檢測(cè)結(jié)果 ρB/(pg·mL-1)； n=8，

*P<0.05與A組相比;△P<0.05與AM組相比;▲P<0.05與PH組相比

表5 各組大鼠與不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-10檢測(cè)結(jié)果 ρB/(pg·mL-1)； n=8，

*P<0.05與A組相比;△P<0.05與AM組相比;▲P<0.05與PH組相比

3 討 論

細(xì)胞因子在肺損傷的炎癥發(fā)展過程中起到十分重要的作用[4-5]。各種原因引起的肺損傷均有細(xì)胞因子參與。光氣所致的肺損傷機(jī)制目前認(rèn)為有?；饔?、酸燒傷理論、氧化應(yīng)激學(xué)說等[6]。其中，炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用。細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中存在相互作用，如：白介素(IL)可激活多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如JAK/STAT、Ras/ERK和PI3K/Akt[7]，MIP-3趨化因子可以通過自分泌作用增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性，促進(jìn)TNF-α產(chǎn)生[8]。

本研究中，光氣致肺損傷時(shí)，促炎因子TNF-α濃度明顯升高，與邵義如等[9]的研究相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，光氣中毒大鼠IL-1β、IL-6、IL-8水平明顯升高。研究[10]發(fā)現(xiàn)，光氣暴露后，小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-6、IL-1β、MIP-2升高。這些研究表明，一些促炎因子在光氣吸入性肺損傷時(shí)可上調(diào)。研究[5, 10]顯示，在肺損傷早期，肺泡巨噬細(xì)胞受抗原刺激后分泌TNF-α，而TNF-α可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等進(jìn)入肺泡腔，且TNF-α及IL-1均可激活免疫細(xì)胞釋放其他細(xì)胞因子，活化Na/K-ATP酶，導(dǎo)致肺水腫。本研究進(jìn)一步證明，在光氣吸入早期(6 h)，肺損傷仍未明顯進(jìn)展時(shí)，促炎因子的血漿濃度均升高。因此認(rèn)為，光氣中毒時(shí)機(jī)體迅速發(fā)生炎癥反應(yīng)，大量免疫細(xì)胞激活，釋放炎癥因子，促進(jìn)肺損傷及肺水腫的發(fā)生發(fā)展。

抗炎因子可負(fù)反饋調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，降低炎癥反應(yīng)程度。IL-4是體內(nèi)主要的抗炎因子，可以抑制Th1細(xì)胞分化，抑制中性粒細(xì)胞激活和調(diào)節(jié)趨化因子[11]。本研究中光氣染毒大鼠血漿IL-4呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，48 h時(shí)明顯高于正常水平。結(jié)果說明，光氣中毒早期，抗炎因子的合成及釋放均被抑制，隨著炎癥反應(yīng)持續(xù)，抗炎因子水平才逐步恢復(fù)。促炎因子與抗炎因子的失衡可能是肺損傷及肺水腫的發(fā)病機(jī)制之一。

目前認(rèn)為BMD-MSCs的抗炎機(jī)制有直接和間接兩種。直接機(jī)制：首先，BMD-MSCs能調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞，使其分泌IL-10，然后通過重組人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhKGF)等因子間接起到抑炎效果[12]；其次，改變樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)免疫應(yīng)答，使成熟的DC1減少TNF-α的分泌，而使DC2增加IL-10的分泌，進(jìn)而導(dǎo)致Th1釋放干擾素γ(INF-γ)減少，Th2、Treg細(xì)胞分泌IL-4、 IL-10增加[13]。間接機(jī)制：BMD-MSCs通過分泌白細(xì)胞介素受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist，IL1Ra)，抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α及T細(xì)胞分泌IL-1，進(jìn)而減輕急性肺損傷時(shí)的炎癥反應(yīng)[14]。續(xù)玉林等[15]通過BMD-MSCs移植，上調(diào)了IL-10的表達(dá)，進(jìn)而減輕了十八烯酸所致的大鼠肺損傷。本研究中，光氣肺損傷大鼠移植BMD-MSCs后，TNF-α降低，IL-4、IL-10升高，與上述研究相似。但是，目前關(guān)于BMD-MSCs對(duì)急性肺損傷的炎癥調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚，還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，BMD-MSCs移植對(duì)光氣致急性肺損傷大鼠有一定保護(hù)作用；BMD-MSCs移植可升高IL-4、IL-10抗炎因子濃度，降低促炎因子TNF-α濃度，說明BMD-MSCs移植可作為治療急性肺損傷的有效手段，值得進(jìn)一步研究。

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[本文編輯] 姬靜芳

The intervention effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on inflammatory factors in lung tissue and plasma of phosgene inhalation lung injury rats

MIN Si-qing, HE Dai-kun, ZHONG Zhi-yue*, CHEN Jun-feng, SHEN Jie

Intensive Care Unit, Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508, China

Objective： To observe the intervention effect of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMD-MSCs) on inflammatory factors in lung tissue and plasma of phosgene inhalation lung injury rats. Methods： 96 male SD rats were randomly divided into air control group (group A), BMD-MSCs intervention control group (group AM), phosgene exposure group (group PH) and BMD-MSCs intervention group after phosgene exposure (group PM), with 8 rats in each group. Group PH was exposed to dynamic constant phosgene at 8.33 mg/L for 5 min. Group PM was injected with 106BMD-MSCs via the tail vein immediately after phosgene exposure. The rats in the 4 groups were sacrificed at 6, 24 and 48 h after the models were completed. The lung tissues were taken for pathological examination, lung wet / dry ratio and blood gas analysis. The plasma was taken for the Bio-Plex cytokine test. Results： The level of TNF-α was higher in group PH than group A, and the difference was statistically significant (P=0.02). The level of TNF-α was lower in the group PM than group PH (P<0.05). The plasma IL-4 concentration in group PM and group PH decreased by 6h and 24 h, which was more significant in group PM (P<0.05). It increased significantly by 48h, which was more significant in group PM (P<0.05). The level of IL-10 was higher in group PM than group PH, and the difference was statistically significant (P<0.05). The level of IL-10 was higher in group PM than group PH, and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusions： Anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-4 were increased and pro-inflammatory cytokines TNF-α was decreased by the tail vein injection of BMD-MSCs, so BMD-MSCs has a protective effect in rats with acute lung injury induced by phosgene.

phosgene; acute lung injury; cytokines; bone marrow-derived mesenchymal stem cells

2017-02-18 [接受日期] 2017-04-10

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2013-11). Supported by Science and Technology Program of Jinshan Hospital, Fudan University(2013-11).

閔思慶, 住院醫(yī)師. E-mail：49162128@qq.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-34189990-5430, E-mail: zzy1388@aliyun.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170124

R -332

A