Caveolin-1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及臨床意義

韓燕燕 朱俊寶 李淑華

Caveolin-1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及臨床意義

韓燕燕 朱俊寶 李淑華

作者單位：371421德州山東省德州市陵城區(qū)中醫(yī)院婦產(chǎn)科

目的探討窖蛋白-1（Caveolin-1）在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組化法及蛋白質(zhì)印跡法檢測45例子宮內(nèi)膜癌組織（內(nèi)膜癌組）、35例子宮內(nèi)膜良性病變組織（良性組）和35例正常子宮內(nèi)膜組織（正常組）中Caveolin-1蛋白的表達(dá)。實時熒光定量PCR法檢測內(nèi)膜癌組中Caveolin-1mRNA的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果Caveolin-1蛋白在內(nèi)膜癌組、良性組、正常組中的表達(dá)呈遞減趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在內(nèi)膜癌組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Caveolin-1mRNA表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P=0.001）；TNM分期Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期者高于Ⅰ期者（P=0.002，P=0.040）；低分化、中分化者顯著高于高分化者（P＜0.001，P=0.020）；Caveolin-1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)與年齡及組織分型無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論Caveolin-1在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和TNM分期有關(guān)，有望成為子宮內(nèi)膜癌早期診斷的指標(biāo)及治療靶點。

子宮腫瘤；子宮內(nèi)膜癌；Caveolin-1；免疫組化

窖蛋白-1（Caveolin-1）是重要的支架蛋白，在細(xì)胞的內(nèi)吞作用、膽固醇轉(zhuǎn)運、分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移和侵襲方面發(fā)揮重要作用［1-2］。Caveolin-1基因起始作為抑癌基因受到重視［3］，但近來研究顯示，Caveolin-1基因高表達(dá)與腫瘤分級、分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)［4］。本研究檢測子宮內(nèi)膜癌組織中Caveolin-1的表達(dá)并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，以探討其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源選擇2013年10月至2015年7月山東省德州市陵城區(qū)中醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜癌患者45例（內(nèi)膜癌組），年齡35～74歲，平均年齡（53.24± 6.52）歲，所有患者術(shù)前均未接受激素治療及放化療；同時收集子宮內(nèi)膜不典型增生35例（良性組），年齡36～73歲，平均年齡（51.38±5.74）歲；子宮內(nèi)膜正常者35例（正常組，因子宮肌瘤行全子宮切除患者），年齡42～71歲，平均年齡（51.17±5.48）歲。3組年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝1.487，P＝0.230）；所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)證實，并經(jīng)患者及家屬同意，簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑濃縮型兔抗人Caveolin-1多克隆抗體購自SantaCruz公司；兔抗人多克隆β-actin抗體購自北京中杉金橋生物科技有限公司；蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、T rizol試劑購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）購自Fermentas公司；實時熒光定量PCR用SYBR-Premix Ex TaqTMII，購自Takara公司；SP免疫組化染色試劑盒、DAB液底物顯色試劑盒購自上海力康生物醫(yī)療有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化法檢測Caveolin-1蛋白表達(dá)水平

4%中性甲醛溶液固定組織標(biāo)本，石蠟包埋，切片后脫蠟，脫苯，水化。按照SP法試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色，以PBS代替一抗作為陰性對照，食管鱗癌切片作為陽性對照。結(jié)果判定：Caveolin-1為膜質(zhì)表達(dá)蛋白，染色陽性為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用彩色圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0，Media Cybernetics公司）對染色結(jié)果進(jìn)行分析，校正圖片光密度，于HIS顏色模式下選中著色陽性區(qū)域，將背景干擾過濾后對每個視野的累計光密度（integral optical denisity，IOD）值進(jìn)行測定。于每張切片隨機選取5個高倍鏡視野（×400），進(jìn)行陽性區(qū)域IOD值測定，5個視野下IOD值的平均值定為該例的最終測定值。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測Caveolin-1蛋白表達(dá)水平取等量收集的新鮮組織（50 mg），以RIPR緩沖液蛋白裂解液裂解組織，粉碎勻漿，4℃靜置24 h，低溫高速離心。取上清液為總蛋白。Bradford法測定蛋白濃度，取等量蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。取下凝膠在40 V轉(zhuǎn)印2 h封閉后，一抗（Caveolin-1，1∶400；β-action，1∶400）4℃孵育過夜，二抗（1∶50）室溫下孵育1 h，TBS洗滌，DAB顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集，進(jìn)行灰度值測定。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測Caveolin-1 mRNA的表達(dá)水平按照Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA，紫外可見分光光度計測定RNA濃度，依據(jù)RNA A260nm/ A280nm≥1.8鑒定RNA純度，－80℃凍存?zhèn)溆?。人Caveolin-1和β-actin引物序列應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件（Premier Biosoft International，CA）設(shè)計，均由Invitrogen公司合成。Caveolin-1引物序列：上游引物為5′-GACTTTGAAGATGTGATTGC-3′，下游引物為5′-AGATGGAATAGACGCTG-3′，擴增產(chǎn)物為254 bp；內(nèi)參β-actin引物序列：上游引物為5′-GCATGGAGTCCTGTGGCAT-3′，下游引物為5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′，擴增產(chǎn)物為324 bp［3］。反轉(zhuǎn)錄體系20μL，包含樣品RNA 2μL，依照Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，獲取cDNA。將20μL體系（cDNA 2μL、SYBR Green 9μL、上下游引物各0.2μL、無菌水8.6μL）加入96孔板進(jìn)行Real-time PCR檢測。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15 s，60℃延伸60 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。每個實驗均重復(fù)3次，采用2－△△Ct（Ct為循環(huán)閾值）方法進(jìn)行相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析不同組織中Caveolin-1的表達(dá)差異；χ2檢驗分析Caveolin-1與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同子宮內(nèi)膜組織中Caveolin-1蛋白的表達(dá)情況

免疫組化法檢測結(jié)果顯示，內(nèi)膜癌組Caveolin-1蛋白表達(dá)為3.12±0.53，高于良性組的1.14±0.41，而后者較正常組的0.93±0.17顯著增高（P＜0.05），見圖1。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，內(nèi)膜癌組Caveolin-1蛋白表達(dá)為0.638±0.024，較良性組的0.497±0.018顯著增高，而良性組較正常組（0.316±0.014）顯著增高（P＜0.05），見圖2。

圖1 不同子宮內(nèi)膜組織中Caveolin-1蛋白的表達(dá)（免疫組化法，×400）

圖2 不同子宮內(nèi)膜組織中Caveolin-1蛋白的表達(dá)

2.2 Caveolin-1 mRNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系

實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果顯示，Caveolin-1 mRNA在內(nèi)膜癌組中的表達(dá)與患者年齡（P＝0.052）、組織學(xué)分型（P＝0.280）無關(guān)。在內(nèi)膜癌組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Caveolin-1 mRNA表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＝0.001）。TNM分期中Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期者Caveolin-1mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.009），進(jìn)一步兩兩比較，結(jié)果顯示，Ⅲ+Ⅳ者與Ⅱ期者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.198），但顯著高于Ⅰ期者（P＝0.002），Ⅱ期者明顯高于Ⅰ期者（P＝0.040）；低分化、中分化、高分化者Caveolin-1mRNA的表達(dá)差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），進(jìn)一步兩兩比較，結(jié)果顯示，低分化者與中分化者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.100），但顯著高于高分化者（P＜0.001），中分化者顯著高于高分化者（P＝0.020）。見表1。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，以來源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌最常見［5］，為絕經(jīng)后婦女常見的惡性腫瘤，發(fā)病率不斷上升，且有年輕化趨勢［6］。目前對子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制進(jìn)行了深入研究，但對其發(fā)生、發(fā)展的分子機制尚未完全明確。

表1 Caveolin-1mRNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表1 Caveolin-1mRNA表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系（±s）

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Caveolin為電子顯微鏡下可辨識的50～100 nm的質(zhì)膜凹陷，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為囊泡。該蛋白家族由Caveolin-1、Caveolin-2、Caveolin-3 3個亞型組成。其中Caveolin-1主要定位于多數(shù)哺乳類動物的終末分化細(xì)胞中［4］，能直接與受體、激酶、黏附分子及G蛋白等信號分子交互作用［7］。推測Caveolin-1可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、黏附和遷移起調(diào)控腫瘤的作用［8］。

本研究分別采用免疫組化法及蛋白質(zhì)印跡法對子宮內(nèi)膜癌組織中Caveolin-1蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示其在內(nèi)膜癌組中的表達(dá)水平顯著高于良性組及正常組，該結(jié)果與Caveolin-1在肺鱗狀細(xì)胞癌［9］、前列腺癌［10］、腎癌［11］、結(jié)直腸癌［12］、肺癌［13-14］中的表達(dá)一致，符合Caveolin-1基因作為癌基因的條件之一［15-16］。進(jìn)一步采用實時熒光定量PCR法分析45例子宮內(nèi)膜癌組織中Caveolin-1 mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：⑴中、晚期（Ⅲ+Ⅳ期）子宮內(nèi)膜癌組織中Caveolin-1 mRNA的表達(dá)顯著高于早期（Ⅰ期），但中、晚期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示Caveolin-1 mRNA可能與子宮內(nèi)膜癌的早期發(fā)生有關(guān)；⑵低分化子宮內(nèi)膜癌組織中Caveolin-1 mRNA的表達(dá)顯著高于中、高分化組織，而中、低分化組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示Caveolin-1 mRNA與子宮內(nèi)膜癌早期發(fā)生相關(guān)；⑶有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織中Caveolin-1 mRNA的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示Caveolin-1 mRNA與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示Caveolin-1可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展，有望為子宮內(nèi)膜癌早期診斷提供依據(jù)。

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［2016-12-31收稿］［2017-02-25修回］［編輯江德吉］

Clinical significance of Caveolin-1 expression in endometrial carcinoma

Han Yanyan，Zhu Junbao，Li Shuhua（Department of Gynaecology and Obstetrics，Dezhou Lingcheng District Hospital of Traditional Chinese Medicine，Dezhou 371421 P.R.China）

Objective Toevaluate theexpression ofCaveolin-1 in endometrialcarcinomaand investigate itsassociationwith pathological features.M ethods Caveolin-1 expression was determined by immunohistochemistry and Western blot using rabbit polyclonal antibody in 45 cases of endometrial carcinoma，35 cases of hyperplastic endometrium，and 35 cases of normal endometrium.Caveolin-1 mRNA levels in endometrial carcinoma tissue were determined using real-time PCR.Results Immunohistochemistry and Western blot showed different rates of positive expression of Caveolin-1 in the different types of endometrium.Caveolin-1 expression tended to increase with degree ofmalignancy（P<0.05）.Among cases with endometrial carcinoma，Caveolin-1 expression wasmuch higher in patients with lymph nodemetastasis（P=0.001），and it was higher in stagesⅡandⅢ+Ⅳthan in stage（P=0.002，P=0.040）. Caveolin-1 expression wasmuch higher in moderate and low-grade endometrial carcinoma than in high-grade endometrial carcinoma（P＜0.001，P=0.020）.Conclusions Caveolin-1 expression is higher in endometrial carcinoma than in hyperplastic or normal endometrium，and it correlates significantly with tumor stage and lymph node metastasis.Caveolin-1 may play an important role in endometrial carcinoma progression.

Uterine neoplasms；Endometrial carcinoma；Caveolin-1；Immunohistochemistry

R737.33

A

1674-5671（2017）03-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.08