CD90和CD44分子在人肝癌組織中的表達(dá)

周四蓮匡志鵬

作者單位：530021南寧廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部

CD90和CD44分子在人肝癌組織中的表達(dá)

周四蓮匡志鵬

作者單位：530021南寧廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部

目的探討肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90和CD44分子在人肝癌組織中的表達(dá)。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化法檢測(cè)40例人肝癌組織及其40例相應(yīng)遠(yuǎn)端癌旁組織中CD90和CD44基因mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果CD90和CD44基因mRNA在肝癌組織中的表達(dá)高于遠(yuǎn)端癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；CD90和CD44陽性分子定位于癌細(xì)胞膜與細(xì)胞漿，CD90和CD44細(xì)胞在肝癌組織中的陽性表達(dá)率分別為82．5%（33/40）和77．5%（31/40），在遠(yuǎn)端癌旁組織中分別為17．5%（7/40）和12．5%（5/40），兩者差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論CD90和CD44分子在人肝癌組織中高表達(dá)，但低表達(dá)于相應(yīng)遠(yuǎn)端癌旁組織，CD90和CD44分子可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)。

肝腫瘤；干細(xì)胞標(biāo)志物；CD90；CD44

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)是主要的治療方法，但死亡率仍然較高，主要原因是術(shù)后復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［1-2］。腫瘤干細(xì)胞是癌細(xì)胞自我更新和分化能力的子集，肝癌干細(xì)胞是具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞，與肝癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為相關(guān)的一類細(xì)胞總稱。目前多項(xiàng)研究認(rèn)為，肝癌侵襲轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)率與肝癌干細(xì)胞有關(guān)，而常見的肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物有CD44、OV6、CD90、CD133、EpCAM、CK19和AFP等［3-5］。本課題組前期對(duì)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90和CD44在化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌模型中的表達(dá)及對(duì)有關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控進(jìn)行研究［6-7］，發(fā)現(xiàn)CD90和CD44分子在小鼠肝癌的發(fā)生和發(fā)展中有一定作用，為進(jìn)一步研究其在人肝癌中的影響，本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化技術(shù)分別檢測(cè)CD90和CD44分子在人肝癌組織中的表達(dá)，以期進(jìn)一步闡明兩者對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2014年1月至2014年12月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科手術(shù)切除的40例肝組織標(biāo)本，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診為肝癌，均屬中低分化，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，術(shù)前未行任何相關(guān)治療。同時(shí)收集相應(yīng)遠(yuǎn)端癌旁組織（距癌組織邊緣5 cm）40例，將組織標(biāo)本快速放入液氮冷凍，置于－80℃冰箱備用。其中男性24例，女性16例；年齡36～68歲，平均年齡（55±0.52）歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)通過，所有患者知情同意。

1.2 試劑與儀器

總RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen有限公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大MBI Fermentas有限公司，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master購自天根生物科技（北京）有限公司?？梗瑿D44和抗－CD90均為多克隆兔抗體，稀釋液濃度為1∶200，均購自武漢博士德生物有限公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)CD90和CD44基因mRNA的表達(dá)

將少量肝組織放入1m L Trizol，電動(dòng)研磨器冰上研磨，提取總RNA。取2μL RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度；1%瓊脂糖制作凝膠，電壓110 V 15 min電泳，根據(jù)電泳結(jié)果分析提出的總RNA質(zhì)量情況；稀釋至工作液濃度（50 ng/μL），置于－80℃冰箱保存。

實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)北京天根生物科技有限公司提供的操作過程進(jìn)行，每個(gè)樣本均做3個(gè)平行試驗(yàn)。組織RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄60℃5min，42℃60min，70℃5min，獲得的模板cDNA加至PCR反應(yīng)體系。CD90上游引物：5'-ACACATACCGCTCCCGAACCAAC-3'，下游引物：5'-GGGCCCCACCAGTCACAGG-3'，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度為282 bp；CD44上游引物：5'-ATTCCCCGGATCC ACCCCAACT-3'，下游引物：5'-GCCGCTGCTCACGTC ATCATCA-3'，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度為282 bp；內(nèi)參基因β-actin上游引物：5'-TGACGTGG ACATCCGCAAAG-3'，下游引物：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長度為388 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)自動(dòng)熒光定量儀讀取熒光信號(hào)。所有循環(huán)結(jié)束后，電腦自動(dòng)分析并將讀取的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成Ct值，得到目的基因及相應(yīng)內(nèi)參基因的Ct值，以2-△△Ct分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 免疫組化法檢測(cè)CD90和CD44蛋白表達(dá)

1.4.1 肝癌組織固定、包埋與切片用40 g/L甲醛將組織固定，石蠟包埋，2μm厚切片。取1片組織切片行常規(guī)HE染色，用于病理診斷；另外2片組織切片行免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)組織中CD90和CD44表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。

1.4.2 組織標(biāo)本脫蠟及水化將組織切片置于60℃恒溫烘箱孵育3 h，依次放入3個(gè)二甲苯缸中，每次10min；將已脫蠟的切片依次放入濃度為100%、95%、80%、75%的乙醇中脫二甲苯，每次5 min；切片在蒸餾水中浸10min，用0.01mmol/L PBS緩沖液洗3次，每次2min。

1.4.3 抗原修復(fù)及封閉將0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH 6.0，工作液）約2 000 mL倒入高壓鍋加熱至沸騰，將切片放入鍋內(nèi)，待高壓鍋緩慢噴氣3min后，室溫冷卻6 min，取出切片，蒸餾水沖洗，PBS漂洗3次，每次2min。取出切片，每張切片滴加1～2滴3%過氧化氫，室溫孵育10min，0.01mmol/L PBS緩沖液洗3次，每次2min。

1.4.4 滴加抗體和封片將稀釋濃度為1∶200的一抗CD90、CD44兔多克隆抗體分別滴加在兩張封閉切片上，置于濕盒內(nèi)，4℃過夜。取出切片，室溫下復(fù)溫20min，0.01mmol/L PBS緩沖液振洗3次，每次2min；室溫孵育20min，0.01mmol/L PBS緩沖液振洗3次，每次2min；滴加二抗，室溫孵育20 min，0.01 mmol/L PBS緩沖液振洗3次，每次2min；滴加DAB顯色劑，水沖洗3min，蘇木素復(fù)染5min，返藍(lán)，脫水，封片。

顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（×100），每個(gè)視野選擇100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞率并評(píng)分：陽性細(xì)胞率為0計(jì)為0分，陽性細(xì)胞率≤25%計(jì)為1分，25%＜陽性細(xì)胞率≤50%計(jì)為2分，50%＜陽性細(xì)胞率≤75%計(jì)為3分，陽性細(xì)胞率＞75%計(jì)為4分。進(jìn)一步按照多數(shù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無顯色計(jì)為0分，淺棕黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，棕褐色計(jì)為3分。將上述2項(xiàng)評(píng)分相加進(jìn)行總評(píng)分：0分為陰性（－），2～3分為弱陽性（+），4～5分為中度陽性（++），6～7分為強(qiáng)陽性（+++）［8］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中CD90和CD44基因mRNA的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，40例肝癌組織中CD90和CD44基因mRNA的表達(dá)顯著高于遠(yuǎn)端癌旁組織（P＜0.05），見表1。

表1 CD90和CD44基因m RNA在肝癌組織及遠(yuǎn)端癌旁組織中的表達(dá)（±s）

表1 CD90和CD44基因m RNA在肝癌組織及遠(yuǎn)端癌旁組織中的表達(dá)（±s）

與遠(yuǎn)端癌旁組織比較，*P＜0.05

達(dá)t 3.337 3.572 P 0.005 0.003

2.2 肝癌組織中CD90與CD44蛋白的表達(dá)

在光學(xué)顯微鏡下觀察肝癌組織和遠(yuǎn)端癌旁組織HE染色，可見癌組織排列紊亂，癌細(xì)胞形態(tài)多樣，核大深染，分葉；遠(yuǎn)端癌旁組織異型核細(xì)胞少，細(xì)胞排列較癌組織整齊（圖1）。觀察肝癌組織中CD90與CD44表達(dá)及定位，發(fā)現(xiàn)兩種肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物均定位于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜。CD90主要表達(dá)于細(xì)胞膜，亦在細(xì)胞漿中表達(dá)（圖2）；CD44主要表達(dá)于細(xì)胞漿，其次是細(xì)胞膜，其陽性細(xì)胞呈分散或簇狀分布在肝癌組織中（圖3）。CD90陽性細(xì)胞在肝癌組織和遠(yuǎn)端癌旁組織中的表達(dá)率分別為82.5%（33/40）和17.5%（7/40），CD44陽性細(xì)胞分別為77.5%（31/40）和12.5%（5/40），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、表3。

圖1 肝癌組織及遠(yuǎn)端癌旁組織HE染色（HE染色，×100）

圖2 肝癌組織及遠(yuǎn)端癌旁組織CD90的表達(dá)

圖3 肝癌組織及遠(yuǎn)端癌旁組織CD44的表達(dá)

表2 肝癌組織及遠(yuǎn)端癌旁組織中CD90陽性表達(dá)的比較（n）

表3 肝癌組織及遠(yuǎn)端癌旁組織中CD44陽性表達(dá)的比較（n）

3 討論

干細(xì)胞是指沒有特定功能的不成熟細(xì)胞，具有多向分化且不斷進(jìn)行自我更新的能力，一般存在于人骨髓中，也可存在于腫瘤組織。隨著對(duì)干細(xì)胞研究的發(fā)展，有學(xué)者提出了腫瘤干細(xì)胞假設(shè)，腫瘤干細(xì)胞可能源于某些具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞或者突變的正常干細(xì)胞［9-11］。存在于肝癌組織中的干細(xì)胞稱作肝癌干細(xì)胞。目前，關(guān)于肝癌干細(xì)胞的研究已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱門學(xué)科之一，肝癌的發(fā)生、發(fā)展及治療亦是我國科學(xué)工作者亟需攻克的一大科學(xué)難題。研究表明，CD90在肝癌組織中的表達(dá)明顯上升，且與肝癌的生物學(xué)行為密切相關(guān)［12］。CD44陽性細(xì)胞具有不斷自我復(fù)制的特性，這一特性與干細(xì)胞相似。有研究證實(shí)，CD44可能參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，促使腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)［13］。

CD90是肝癌干細(xì)胞的重要標(biāo)志物［14］。它主要參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞與細(xì)胞質(zhì)的相互作用，可能與炎癥、纖維化及細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移有關(guān)。CD44是廣泛分布于各類細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，屬于細(xì)胞黏附因子家族的一類。相關(guān)研究證實(shí)CD44陽性細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性，同時(shí)具有更強(qiáng)的致瘤能力和更容易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)［15-16］。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化法分析40例肝癌組織及其相應(yīng)遠(yuǎn)端癌旁組織中CD90和CD44的表達(dá)，結(jié)果顯示CD90和CD44在肝癌組織中的表達(dá)量高于遠(yuǎn)端癌旁組織，與Gomes等［17］的研究相似。有研究證實(shí)，隨著肝癌干細(xì)胞發(fā)展，肝癌組織中CD90和CD44的表達(dá)量高于遠(yuǎn)端癌旁組織［6，18］。因此推測(cè)CD90和CD44可能通過影響肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和影響細(xì)胞表面的跨膜蛋白而參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，其相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

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［2016-12-21收稿］［2017-02-10修回］［編輯羅惠予］

Expression of CD90 and CD44 in human hepatoma tissues

Zhou Silian，Kuang Zhipeng（Department of Research，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）Corresponding author：Kuang Zhipeng.E-mail：kgzhou@163.com

Liver neoplasms；Stem cellmarkers；CD90；CD44

R735.7

A

1674-5671（2017）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.05

廣西腫瘤學(xué)優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目（024012002）

匡志鵬。E-mail：kgzhou＠163．com

【Abstract】Objective To investigate differences in CD90 and CD44 expression between human hepatoma and distal liver.M ethod Expression of CD90 and CD44 wasmeasured using quantitative real-time PCR in human hepatoma and distal liver tissue，and the expression of both proteins was detected by immunohistochemistry.Results Expression of CD90 and CD44 mRNA was significantly higher in human hepatoma than in distal liver（P<0.05）.CD90 and CD44 proteins localized to themembrane and cytoplasm of cancer cells.In human hepatoma，the CD90-positive rate was 82.5%（33/40）and the CD44-positive rate was 77.5%（31/40）；the corresponding values in distal liver tissue were significantly lower：17.5%（7/40）and 12.5%（5/40）（P<0.05）.Conclusion Human liver cancer tissue shows high expression of CD90 and CD44，while distal liver tissue shows low expression.CD90 and CD44 may correlate significantly with the incidence and development of liver cancer.