脫脂和脫蛋白處理對蟲草多糖測定的影響

方蘇++閆興富++周立彪

摘要：以蟲草發(fā)酵菌粉為材料，比較多糖提取過程脫脂、脫蛋白操作對硫酸-苯酚法和硫酸-蒽酮法測定多糖值的影響。研究結(jié)果表明，同一樣品提取多糖時不脫脂和蛋白（A）、只脫脂（B）、只脫蛋白（C）、脫脂脫蛋白（D）對硫酸-蒽酮法與硫酸-苯酚法測定結(jié)果差異顯著，2種比色法測得多糖含量值均呈現(xiàn)A>B>C>D，其中脫蛋白的操作比脫脂操作對2種比色法測定結(jié)果影響更大。同時還顯示，硫酸-苯酚法測得的多糖含量較硫酸-蒽酮法測得值大。并通過精密度、回收率、穩(wěn)定性比較發(fā)現(xiàn)，硫酸-苯酚法優(yōu)于硫酸-蒽酮法。

關(guān)鍵詞：蟲草多糖；脫脂；脫蛋白；含量測定；硫酸-苯酚法；硫酸-蒽酮法

中圖分類號： R284.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0144-03

測定多糖含量的方法主要有比色法、高效液相色譜法和酶法等，其中高效液相色譜法與酶法由于樣品前處理工序比較繁瑣，測定時間較長，檢測費用較高等原因未能廣泛使用，而比色法中的苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法由于操作簡單、實用性強，在多糖研究中被廣泛使用[1]。比色法多糖含量測定包括提取和含量測定2部分，農(nóng)業(yè)部標準食用菌中粗多糖含量的測定（硫酸-苯酚法）[2]及中國藥典[3]靈芝多糖含量的測定（硫酸-蒽酮法）均為粗多糖的測定，前者是醇洗后水提，后者是水提后醇沉，均不脫脂不脫蛋白?，F(xiàn)行的多糖提取處理與多糖測定的基本流程可歸納為：菌粉→脫脂（兼脫色）→水提→醇沉→脫蛋白→得精多糖液→顯色反應→比色，實際研究中的具體操作各有不同，主要區(qū)別在于多糖提取是否經(jīng)脫脂處理或是否經(jīng)脫蛋白處理，包括不脫脂和蛋白[4-7]、只脫脂[8-9]和只脫蛋白處理等[10-13]。目前，采用2種比色法進行不同提取處理測定蟲草多糖之間的差異還缺乏研究，因此，本研究以蟲草菌粉為材料，在多糖提取過程中，通過脫脂和脫蛋白處理，用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法進行多糖的測定，研究脫脂和脫蛋白處理對蟲草多糖測定結(jié)果的影響，為完善蟲草多糖測定方法和蟲草相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料：冬蟲夏草菌來源于中國科學院微生物研究所，經(jīng)5 L發(fā)酵罐發(fā)酵、過濾、烘干、粉碎研磨制得。

儀器：分光光度計UV1000，上海精科天美；離心機HC-3016，安徽中科中佳；索氏提取器GG-17 50/42，上海喬楓；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA，上海亞榮；移液槍。

試劑：濃硫酸、苯酚、蒽酮、乙醚、氯仿、乙醇（均為分析純）。

1.2試驗設計

本試驗共設4個處理，分別為A：不脫脂也不脫蛋白（對照）；B：脫脂；C：脫蛋白；D：既脫脂又脫蛋白。其中處理B依次包括：脫脂、水提、醇沉、定容和多糖測定；處理C依次包括：水提、醇沉、脫蛋白、定容和多糖測定；處理D依次包括：脫脂、水提、醇沉、脫蛋白、定容和多糖測定。

1.3樣品處理和多糖提取

1.3.1脫脂稱取1.00 g研磨后的菌粉，濾紙包裹于盛有 250 mL 乙醚的索氏提取器，42 ℃回流2 h，取出揮發(fā)干[7]。

1.3.2水提將菌粉置于三角瓶中，加水100 mL，95 ℃下浸提1 h，浸提2次合并，8 000 r/min離心10 min后，取上清液于55 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至約50 mL[9]。

1.3.3醇沉將濃縮液加入3倍體積的95%乙醇，靜置于 4 ℃ 冰箱中12 h。于8 000 r/min下離心10 min，取沉淀，再用無水乙醇洗滌后離心，取沉淀90 ℃熱水復溶至50 mL[9]。

1.3.4脫蛋白將上述復溶的溶液置于分液漏斗，加入Sevage試劑（氯仿 ∶正丁醇體積比4 ∶1）15 mL，振蕩后靜置 5 min，棄下層有機相，重復5次，得多糖液[10]。

1.3.5定容將上述制備好的多糖溶液加蒸餾水定容至100 mL待測。

1.4多糖的測定

1.4.1硫酸-苯酚法[2]

1.4.1.1苯酚溶液的配制稱取80 g苯酚溶于蒸餾水，定容至100 mL，于棕色瓶中4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆茫粚嶋H使用時現(xiàn)用現(xiàn)配5%的苯酚溶液。

1.4.1.2標準曲線的制備稱取干燥葡萄糖0.010 g，溶于蒸餾水定容至100 mL；分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 葡萄糖液置于具塞試管中，加蒸餾水至2 mL，另取1支試管加入蒸餾水2 mL作為空白對照。將上述每一試管中分別加入苯酚溶液1 mL，加5 mL濃硫酸，靜置10 min，渦旋振蕩混勻，30 ℃反應20 min，于490 nm下測定吸光度。

1.4.1.3樣液的測定取定容后的樣液0.20 mL，加蒸餾水至2 mL，按照標準曲線制備項下的方法，自加入苯酚溶液起，測定吸光度。

1.4.1.4多糖含量的計算根據(jù)測得的吸光度值，按以下公式計算多糖百分含量w。

式中：m1為回歸方程換算出多糖濃度（mg/mL）；V1為樣品定容體積（mL）；m2為樣品濃度（mg/mL）；V2為比色測定時所移取樣品測定的體積（mL）；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.4.2硫酸-蒽酮法[3]

1.4.2.1硫酸蒽酮溶液配制準確稱取0.2 g蒽酮，緩慢加入100 mL濃硫酸，溶解置于棕色瓶避光保存。

1.4.2.2標準曲線的制備稱取干燥葡萄糖0.010 g，溶于蒸餾水定容至100 mL，分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 葡萄糖液置于具塞試管中，加蒸餾水至2 mL，另取1支試管加入蒸餾水2 mL作為空白對照。分別加入蒽酮硫酸溶液6 mL搖勻，沸水浴15 min，冰水浴15 min，625 nm下測定吸光度。

1.4.2.3樣液的測定取定容后的樣液0.2 mL于具塞試管中，加蒸餾水溶解定容至2 mL，按照標準曲線制備項下的方法，自加入硫酸蒽酮溶液起，測定吸光度。

1.4.2.4多糖含量的計算同硫酸-苯酚法。

1.5回收率試驗[14]

取處理D樣液0.2 mL于具塞試管中，加入0.1 mg/mL標準葡萄糖溶液0.4 mL，蒸餾水定容至2.0 mL，按照“1.4.1”節(jié)硫酸-苯酚法和“1.4.2”節(jié)硫酸-蒽酮法的測定方法測定多糖含量，重復5次，按下述公式計算回收率：回收率=（c-a）/b×100%。式中：a為供試品所含多糖的量；b為加入對照品的量；c為實測值。

1.6穩(wěn)定性試驗[7]

按照試驗設計中處理D的操作步驟，在用硫酸-苯酚法和硫酸-蒽酮法進行多糖測定時，分別延遲10、20、30、40、50、60、90、120 min后再進行吸光度測定，比較2種多糖測定方法測得的吸光度差異。

1.7數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS Statistics 20軟件用單因素方差分析的方法對不同處理間差異進行方差分析。

2結(jié)果與分析

2.12種測定方法的標準曲線

按照上述硫酸-苯酚法標準曲線制備方法，得到葡萄糖標準曲線（圖1）。硫酸-苯酚法濃度-吸光度線性回歸方程[JP3]為y=11.029x+0.022，相關(guān)系數(shù)r=0.996 3，吸光度在 0.132～0684（0.01～0.06 mg/mL）范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

按照上述硫酸-蒽酮法標準曲線制備方法，得到葡萄糖標準曲線（圖2）。硫酸-蒽酮法濃度-吸光度線性回歸方程為y=8.051 4x-0.002 5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0，吸光度在 0.078～0.480（0.01～0.06 mg/mL）內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2不同處理對2種方法測定結(jié)果的影響

2.2.1硫酸-苯酚法從表1可以看出，A、B、C、D處理樣品測得的蟲草多糖含量分別為5.19%、4.77%、3.35%、2.56%，其中，B、C處理測得的含量分別為A處理的 91.91%、64.54%，D處理樣品測得的精多糖含量為A處理測得的粗多糖含量的49.32%；3個處理組與對照間均差異明顯。

2.2.2硫酸-蒽酮法3個處理組樣品測得的多糖值分別為3.88%、2.99%、2.45%，3個處理均明顯小于對照，其中B、C處理測得的蟲草多糖含量分別是A處理的87.78%、67.64%，C處理對蟲草多糖含量的影響比B處理影響較大；D處理樣品測得的精多糖含量為A處理測得的粗多糖含量的55.43%（表1）。

2.32種測定方法的比較

2.3.1多糖值及其精密度

硫酸-苯酚法A、B、C 3種處理多糖含量測定值均大于硫酸-蒽酮法的測定值，前者分別比后者高出17.42%、22.94%、12.04%，但2種測定方法在D處理的測定結(jié)果接近。

硫酸-苯酚法A、B、C、D 4種處理測定結(jié)果的相對標準偏差分別為1.85%、1.19%、1.31%、1.55%；硫酸-蒽酮法對應A、B、C、D 4種處理樣的RSD值分別為1.89%、2.10%、1.46%、1.89%，硫酸-苯酚法的RSD值低于硫酸-蒽酮法，硫酸-苯酚法較硫酸-蒽酮法具有更高的精密度。

2.3.2回收率

硫酸-苯酚法與硫酸-蒽酮法回收率分別為99.04%、102.00；相對標準誤差分別為1.78%、2.55%（表2）。

2.3.3穩(wěn)定性

從圖3可以看出，在0～120 min時間范圍內(nèi)，硫酸-苯酚法測得的吸光度隨時間的變化幅度較小，相對標準誤差為0.83%，硫酸-蒽酮法測得的吸光度隨時間的變化較為明顯，相對標準誤差為3.93%。在0～30 min內(nèi)，硫酸-苯酚法測得的吸光度基本穩(wěn)定，硫酸-蒽酮法在0～30 min 的吸光度略有下降。

3討論

多糖提取脫脂、脫蛋白處理都造成測定值的差異，影響因素包括有機項干擾、多糖流失及操作條件等。脫脂操作2種比色法測定的多糖含量較粗多糖含量均有減少，乙醚回流脫脂兼有脫色作用，本試驗因由濾紙包裹回流，即使吸光度減少，屬排除有機項干擾，無多糖損失。脫蛋白操作本試驗采用的是研究中較多用到的Sevage法[10-13]，2種比色法測得的多糖含量值均大幅減少，相比粗多糖含量減少達33%以上。原因在于脫蛋白Sevage試劑萃取分相時易造成多糖的流失，萃取次數(shù)多少可能是影響的主要因素，有研究結(jié)果認為，萃取次數(shù)為4次時蛋白質(zhì)脫除率高，但多糖損失率也高[15]。因此，在排除蛋白干擾的同時，可能會造成多糖流失，導致脫蛋白處理的測定值表現(xiàn)為較大幅度減少的現(xiàn)象。

與硫酸-蒽酮法相比，硫酸-苯酚法測得的4種處理的多糖值均較高，可能與顯色反應對干擾項的敏感程度有關(guān)。2種呈色強度分別與溶液中糖的濃度成正比，2種顯色反應對干擾項的敏感度可能不同。有研究結(jié)果認為，這2種比色法在測定多個不同樣品時多糖含量差別很大[16]。本試驗對去除脂類和蛋白質(zhì)干擾的D處理既脫脂又脫蛋白來說，2種比色法測得的多糖含量趨于接近，干擾項的存在可能是造成差異的主要因素。

從穩(wěn)定性看，在120 min內(nèi)硫酸-苯酚法顯色更為穩(wěn)定，而硫酸-蒽酮法測得的吸光度值隨著比色時間的延長而減小，因為多糖在硫酸-蒽酮試劑作用下形成的衍生物可能受反應時間及環(huán)境溫度變化的影響，從而造成顯色反應不穩(wěn)定[1]?？傮w上看，硫酸-苯酚法與硫酸-蒽酮法作為操作易實現(xiàn)、應用性強的2種比色法，均可用于蟲草多糖的測定，硫酸-苯酚法的精密度更高、回收率和穩(wěn)定性更好，及試劑配制、顯色反應步驟也更為簡易，更適于蟲草多糖的測定。

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