葡萄中白藜蘆醇合成酶基因的克隆及其轉(zhuǎn)化黃芪研究

孫詩(shī)雯++張笑笛++宋宇

摘要：利用RT-PCR技術(shù)從巨峰葡萄中克隆獲得RS基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化黃芪。試驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)Vector NTI 11.0軟件分析克隆獲得的RS基因全長(zhǎng)序列長(zhǎng)度為1 241 bp，并帶14 bp長(zhǎng)度的poly（A）尾巴，包含930 bp的開放讀碼框（ORF），編碼1個(gè)含310個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：RS基因編碼白藜蘆醇合成酶，對(duì)RS基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，證明該基因具有查爾酮合成酶N端保守結(jié)構(gòu)域，其長(zhǎng)度為225個(gè)氨基酸。對(duì)黃芪進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果表明：獲得了3棵黃芪轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，通過(guò)DNA、RNA以及蛋白質(zhì)水平證明RS基因已經(jīng)完全整合到黃芪基因組中并表達(dá)。

關(guān)鍵詞：白藜蘆醇合酶基因（RS）；白藜蘆醇；生物信息學(xué)；基因克?。籅last2go

中圖分類號(hào)： S663.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）09-0038-03

白藜蘆醇（resveratrol，3，4′，5-trihydroxystilbene，簡(jiǎn)稱Res）是1940年首次從毛葉藜蘆（Veratrum grandiflorum）的根部獲得的[1]。多年來(lái)，隨著植化技術(shù)的提高以及藥理學(xué)試驗(yàn)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Res廣泛存在于種子植物中，如葡萄[2]、花生[3]、虎杖[4]等。它具有許多醫(yī)療保健作用，如抗氧化、抗腫瘤、抗血小板凝聚、抗細(xì)菌和真菌、免疫護(hù)肝、治療心血管病以及植物雌激素作用等[5-6]，因此Res已成為科學(xué)家們高度重視的天然活性成分。白藜蘆醇合酶（resveratrol synthase，簡(jiǎn)稱RS）是Res生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，它以 4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A為底物催化合成Res[7]。RS基因已在多種植物和微生物中進(jìn)行了轉(zhuǎn)化和表達(dá)，并在植物的代謝及調(diào)控等方面發(fā)揮生物學(xué)作用。通過(guò)植物基因工程改良植物對(duì)病原菌的抗性已成為一種有效且切實(shí)可行的策略，Res的高效抗菌能力已得到一致認(rèn)可，因此基于RS基因的轉(zhuǎn)基因植物很具研究前景，其次Res的藥理活性也已日益引起人們的關(guān)注。但天然的植物中存在的Res畢竟是微量的，對(duì)RS的分子生物學(xué)研究將使利用基因工程、轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)生產(chǎn)大量Res成為可能，因此對(duì)Res和RS的深入研究將為提高植物的抗性和人類的健康水平提供有效途徑。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料（1）葡萄：巨峰葡萄，購(gòu)自于水果市場(chǎng)；黃芪：膜莢黃芪，購(gòu)自于種子公司。

1.1.2菌種和試劑（1）大腸桿菌感受態(tài)DH5α，購(gòu)自于天根試劑有限公司，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室活化保存。（2）農(nóng)桿菌菌種EHA105，購(gòu)自于天根試劑有限公司，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室活化備用。（3）植物克隆載體pMD18-T Vector，購(gòu)自于天根試劑有限公司。（4）植物表達(dá)載體pBR121，購(gòu)自于天根試劑有限公司；植物RNA快速提取試劑盒，購(gòu)自于美國(guó)Bio-Rad公司；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自于大連寶生物公司；羅氏Ⅱ型高效地高辛DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自于美國(guó)Roche公司；其他分子生物學(xué)和組織培養(yǎng)等相關(guān)試劑，購(gòu)自于天根試劑公司和國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.3培養(yǎng)基大腸桿菌的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基為YEB固體培養(yǎng)基和YEB液體培養(yǎng)基，植物材料的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1葡萄總RNA的提取將從市場(chǎng)上買回的巨峰葡萄經(jīng)過(guò)液氮處理，然后參考Bio-Rad公司植物RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取，電泳檢測(cè)提取的RNA質(zhì)量，并將其保存在-80 ℃冰箱中，為下一步反轉(zhuǎn)錄備用。

1.2.2RS基因的克?。?）cDNA第一條鏈合成：參考大連寶生物公司PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑的說(shuō)明書進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成，反應(yīng)體系在 42 ℃ 條件下合成1 h，待反應(yīng)結(jié)束后再將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)到65 ℃條件的恒溫金屬浴中處理5～10 min，使反應(yīng)體系過(guò)程中的逆轉(zhuǎn)錄酶失活，最后放置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＃?）RT-PCR反應(yīng)體系：根據(jù)GenBank中已經(jīng)注冊(cè)的RS基因（基因編號(hào)為：NM_001281044.1，GI編號(hào)為：526118256）序列，利用在線ORF Finder軟件和MEME軟件尋找序列的開放閱讀框，利用Vector NTI 11.0軟件設(shè)計(jì)引物。其中引物上添加相對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)，上游引物PF序列為：CTAC[ZZ（Z]CCGGG[ZZ）]TGGCTTCAGTCGAGGAATT，其中下劃線為SmaⅠ的限制性酶切位點(diǎn)；下游引物PR序列為：GTA[ZZ（Z]GAGCTC[ZZ）]TACGGTTACAAATTAAGTG，其中下劃線為SacⅠ的限制性酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為100 μL，其中包括：20 μL cDNA模板，10 μL 10×Taq DNA Polymeras Buffer，8 μL 10 mmol/L dNTPs，5 μL引物PF，5 μL 引物PR，6 μL Taq DNA Polymeras，ddH2O補(bǔ)齊至 100 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。（3）產(chǎn)物序列測(cè)序以及其生物信息學(xué)分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因片段。再將純化回收的目的基因片段與pMD18-T載體連接，并將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選試驗(yàn)，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。最后將驗(yàn)證的菌液以M13通用引物進(jìn)行測(cè)序，該工作由北京華大公司測(cè)序完成。

1.2.3RS基因測(cè)序結(jié)果生物信息學(xué)分析將測(cè)序的結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)。利用Blast2go軟件[6-7]（http：//www.blast2go.com/b2ghome）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用Pfam在線軟件[8]（http：//pfam.xfam.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

1.2.4RS基因轉(zhuǎn)化黃芪的研究首先繪制農(nóng)桿菌EHA105的生長(zhǎng)曲線，確定O550=0.6時(shí)候?yàn)檗r(nóng)桿菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后將RS基因與表達(dá)載體pBR121連接，并將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105中，備用。最后，轉(zhuǎn)化筆者所在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立好的黃芪再生體系中，篩選抗性植株，并對(duì)抗性植株進(jìn)行煉苗、移栽，最終收獲轉(zhuǎn)基因黃芪陽(yáng)性植株。

1.2.5黃芪轉(zhuǎn)基因抗性植株的鑒定（1）轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性黃芪植株基因組DNA提?。簠⒖继旄局参顳NA快速提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性黃芪植株的基因組DNA提取，然后進(jìn)行純化，保存于-20 ℃冰箱備用。（2）轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性黃芪植株P(guān)CR檢測(cè)：PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。（3）轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性黃芪植株Southern blot雜交檢測(cè)：Southern blot雜交檢測(cè)參考羅氏Ⅱ型高效地高辛DNA標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，然后進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、洗膜和顯色。最后將濾膜，置于含有NBT/BCIP的Detection buffer中，避光靜止16 h，觀察斑點(diǎn)顏色變化；完成后用TE緩沖液清洗濾膜5 min，觀察、成像、記錄。（4）轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性黃芪植株RT-PCR檢測(cè)：PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸7 min；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1RS基因全長(zhǎng)序列的克隆與分析

以提取的巨峰葡萄cDNA為模版，利用設(shè)計(jì)好的引物PF和PR進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果獲得大約為1 200 bp的目的條帶。將目的條帶經(jīng)過(guò)純化后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中，通過(guò)篩選陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR檢驗(yàn)和測(cè)序分析，結(jié)果表明：RT-PCR獲得的目的片段長(zhǎng)度為1 241 bp（圖1），同時(shí)將該片段的核苷酸序列與NCBI中的序列比對(duì)，其結(jié)果與已經(jīng)公布的RS基因（登錄號(hào)：AF128861）的同源性達(dá)到95%。因此，認(rèn)為已經(jīng)成功獲得了RS基因的全長(zhǎng)編碼序列。

2.2RS基因全長(zhǎng)cDNA序列生物信息學(xué)分析

通過(guò)Vector NTI 11.0軟件對(duì)已經(jīng)獲得的RS基因的全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析，獲得葡萄中的RS基因序列全長(zhǎng)為 1 241 bp，并帶有14 bp長(zhǎng)的Poly（A），克隆獲得的RS基因起始密碼子ATG位于194 nt處，終止密碼子TAG位于1 124 nt處。全長(zhǎng)為1 241 bp序列中包含194 bp長(zhǎng)度的5′端非翻譯區(qū)（UTR，untranslated region）、117 bp長(zhǎng)度的3′端非翻譯區(qū)以及930 bp長(zhǎng)度的開放讀碼框（ORF）區(qū)，RS基因編碼1個(gè)含310個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，經(jīng)預(yù)測(cè)編碼白藜蘆醇合成酶。

再將已經(jīng)獲得的葡萄中的RS基因全長(zhǎng)序列編輯成fasta格式文件，利用生物信息學(xué)軟件Blast2go對(duì)RS基因進(jìn)行功能注釋分析和KEGG代謝途徑分析。由功能注釋結(jié)果可知，RS基因被功能注釋為白藜蘆醇合成酶。由KEGG代謝途徑注釋結(jié)果分析可知，RS基因的酶標(biāo)號(hào)為EC 2.3.1.95，是黃酮類以及黃酮醇類化合物生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因。由圖2對(duì)該基因編碼的蛋白保守域分析結(jié)果可知，獲得的RS基因全長(zhǎng)序列包含了完成的查爾酮合成酶N端保守結(jié)構(gòu)域，其長(zhǎng)度為225個(gè)氨基酸。綜上所述，通過(guò)生物信息學(xué)分析為RS基因參與的黃酮類和黃酮醇類化合物生物合成機(jī)制的研究提供了生物信息學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

2.3RS基因轉(zhuǎn)化黃芪的研究

將已經(jīng)克隆獲得的RS基因，與表達(dá)載體pBR121連接，構(gòu)建成為pBR121-RS表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，最后對(duì)黃芪子葉和胚軸為外植體進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得再生植株。本試驗(yàn)共分40批接種外植體2 080塊，其中子葉1 040塊，胚軸1 040塊。培養(yǎng)2 d后進(jìn)行侵染；侵染后共培養(yǎng)2 d；最后篩選培養(yǎng)，每10 d繼代1次。培養(yǎng)30 d統(tǒng)計(jì)不定芽再生率，其中胚軸不定芽再生率為221%，子葉的不定芽再生率為15.9%。對(duì)所獲得的抗性芽進(jìn)行生根、煉苗、移栽，最后共獲得抗性植株11棵（圖3）。

2.4轉(zhuǎn)基因黃芪植株的鑒定

對(duì)取得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的抗性11棵植株的基因組進(jìn)行DNA提取，經(jīng)檢測(cè)質(zhì)量和純度完好，結(jié)果見圖4。

利用試驗(yàn)所述方法對(duì)11棵轉(zhuǎn)基因黃芪陽(yáng)性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)表達(dá)載體的左右2個(gè)區(qū)是否成功轉(zhuǎn)入到黃芪基因組中。PCR結(jié)果如圖5和圖6所示，左區(qū)擴(kuò)增條帶為 750 bp 左右，右區(qū)擴(kuò)增條帶為400 bp左右，均與載體左右2個(gè)區(qū)設(shè)計(jì)的PCR目的引物大小相同，初步鑒定目的基因整合入黃芪基因組中。

為進(jìn)一步鑒定RS基因在黃芪基因組中的整合及轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行Southern blot雜交，結(jié)果如圖7所示，轉(zhuǎn)基因植株3棵具有雜交信號(hào)，其余8數(shù)植株無(wú)明顯信號(hào)，進(jìn)一步證明目的基因已整合到黃芪基因組中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。從雜交結(jié)果可以看出，不同植株的信號(hào)強(qiáng)弱不同，說(shuō)明其表達(dá)量不同，可能與不同植株個(gè)體整合外源基因的拷貝數(shù)及插入位點(diǎn)不同有關(guān)。

3結(jié)論

本研究利用RT-PCR技術(shù)從巨峰葡萄中克隆獲得RS基因的全長(zhǎng)序列。通過(guò)生物信息學(xué)分析該基因全長(zhǎng)序列，并利用農(nóng)桿菌浸染的方法將其對(duì)黃芪進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)對(duì)黃芪陽(yáng)性植株鑒定，從DNA、RNA以及蛋白質(zhì)水平證明RS基因已經(jīng)完全整合到黃芪基因組中并表達(dá)。本研究通過(guò)結(jié)合生物學(xué)知識(shí)和生物信息學(xué)分析，更進(jìn)一步對(duì)RS基因的信息進(jìn)行解讀，重點(diǎn)從轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面上解釋了RS基因參與黃酮類和黃酮醇類化合物生物合成途徑中的關(guān)系，更明晰了白藜蘆醇的生物合成代謝的積累機(jī)制，為日后提高白藜蘆醇的定向生成提供了有價(jià)值的理論參考。

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