ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在園林植物中的應(yīng)用

張兆祥

摘要：主要從遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系與分類學(xué)研究和種質(zhì)資源鑒定研究3個(gè)方面介紹了ISSR分子標(biāo)記在園林植物中的應(yīng)用，并探討其存在的問題。

關(guān)鍵詞：ISSR；遺傳多樣性；親緣關(guān)系；植物分類學(xué)；種質(zhì)資源；園林植物

0前言

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（inter-simple sequence repeat），即ISSR DNA分子標(biāo)記技術(shù)是一種根據(jù)廣泛存在于植物中的微衛(wèi)星序列，在其3端或5端上各加2～4個(gè)非重復(fù)隨機(jī)核苷酸序列做為引物，引起特定位點(diǎn)退火并對(duì)重復(fù)序列間的DNA片段進(jìn)行PRC擴(kuò)增的第2代分子標(biāo)記技術(shù)。相對(duì)于第1代分子標(biāo)記技術(shù)，ISSR標(biāo)記技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：模版DNA用量較??；引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，成本低；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有良好的穩(wěn)定性和豐富的多態(tài)性；產(chǎn)物重復(fù)性好；實(shí)驗(yàn)的安全性較高以及技術(shù)難度性較低等。由于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有以上特點(diǎn)，現(xiàn)已在遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育等研究方面被廣泛應(yīng)用。本文就其中幾個(gè)方面談?wù)勥@種新型標(biāo)記技術(shù)在園林植物中的應(yīng)用。

1ISSR標(biāo)記技術(shù)在園林植物中的應(yīng)用

1.1園林植物遺傳多樣性研究

遺傳多樣性本質(zhì)為生物體遺傳物質(zhì)上的變異，是探討植物適應(yīng)能力和生存能力的基礎(chǔ)，也是研究植物致瀕機(jī)理的基礎(chǔ)，大量實(shí)驗(yàn)證明，物種遺傳變異大小與它進(jìn)化速度成正比，一個(gè)種群的遺傳多樣性越低，適應(yīng)環(huán)境的能力也越低，就無(wú)法在相對(duì)惡劣的環(huán)境中生存下去，最終導(dǎo)致滅絕。

Lu00等對(duì)杜鵑山茶花進(jìn)行遺傳多樣性分析，10條引物對(duì)2個(gè)亞種群的60個(gè)單株共擴(kuò)增出85個(gè)條帶，多態(tài)性條帶47個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率55.29%，Nei多樣性指數(shù)0.2196，Shannon多樣性指數(shù)0.3215，種群間遺傳分化系數(shù)0.0922，表明杜鵑山茶花較低的遺傳多樣性，并分析該現(xiàn)象的原因與人為活動(dòng)影響有關(guān)。李單琦在福建柏研究中表明，福建柏種群間和種群內(nèi)均具有較高的遺傳多樣性，7個(gè)種群總體觀測(cè)等位基因數(shù)Na為1.8218，有效等位基因數(shù)Ne為1.4313，Nei遺傳多樣性指數(shù)h為0.2582，Shannon信息指數(shù)I為0.3940；種群內(nèi)Na指數(shù)平均為1.3720，Ne指數(shù)平均為1.2892，Nei指數(shù)平均為0.1600，Shannon指數(shù)平均為0.2035。由此推論，導(dǎo)致福建柏瀕危并非由于遺傳多樣性的缺乏，而是人為對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境的破壞導(dǎo)致其居群規(guī)模不斷減小，生境片段化，使種群間基因交流減少，增加了近交和遺傳漂變作用。

1.2園林植物親緣關(guān)系與分類學(xué)研究

植物生長(zhǎng)過程中由于混合花雜交選種或?qū)嵣x種，會(huì)有許多自然雜種的存在，因而具有比較復(fù)雜的遺傳背景，傳統(tǒng)的幾大標(biāo)記方法（形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記）在對(duì)植物進(jìn)行分類研究時(shí)，均存在一定的缺陷，不具備較強(qiáng)的說(shuō)服力，而從DNA層面進(jìn)行研究的ISSR標(biāo)記技術(shù)可以很好地解決這一問題。

李雪萍等對(duì)我國(guó)的珍稀瀕危植物洪桐的6個(gè)天然居群與2個(gè)人工居群共計(jì)229份樣品進(jìn)行ISSR分析，證明該洪桐居群缺乏有效基因交流，其中湖北長(zhǎng)陽(yáng)陳祥灣與星斗山保護(hù)區(qū)（洪桐灣）的遺傳相似度最小為0.8484，說(shuō)明兩者親緣關(guān)系最近，而湖北長(zhǎng)陽(yáng)陳祥灣與星斗山保護(hù)區(qū)（長(zhǎng)灣）的遺傳相似度最大為0.9278，說(shuō)明其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，通過UPGMA方法對(duì)居群間Nei指數(shù)進(jìn)行分析得出洪桐居群間的遺傳分化與地理距離沒有直接相關(guān)性。莫文娟對(duì)泡桐屬植物的親緣關(guān)系進(jìn)行研究，采用UPGMA法將研究材料分成毛泡桐組、白花泡桐組和川泡桐組3大組，地理分布較近的種質(zhì)聚類在一起，表現(xiàn)出較密切的親緣關(guān)系；在對(duì)蘭考泡桐、山明泡桐、白花蘭考泡桐、楸葉泡桐、圓冠泡桐、亮葉毛泡桐、毛泡桐、白花泡桐、川泡桐的親緣關(guān)系分析及分類處理上，基本上與形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、同工酶的研究結(jié)果一致。

1.3園林植物種質(zhì)資源鑒定研究

園林植物種質(zhì)鑒定有物種間、種群內(nèi)、種群間不同品種、不同地理群的鑒定及雜交種、親子鑒定等。物種間基因組差異大，容易鑒定，通過形態(tài)和多種標(biāo)記易區(qū)分；物種內(nèi)不同種屬、不同地理群體或雜交品系的鑒定區(qū)分比較復(fù)雜，在形態(tài)上無(wú)法辨別，需要尋找品種特異性或地理群體特異性的標(biāo)記。在同一物種的各個(gè)品種間存在大量的多態(tài)性標(biāo)記，某一品種具有區(qū)別于其它品種的獨(dú)特標(biāo)記，即一些特異性DNA片段的組合就稱為該品種的“指紋”。各品種獨(dú)特的指紋片段構(gòu)成該物種DNA指紋庫(kù)。

李單琦運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，通過對(duì)17個(gè)引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)篩選比較得出，引物UBC849可以將供試的24份福建柏樣本完全鑒別出來(lái)，表現(xiàn)出較好的鑒別能力，并基于此結(jié)果形成特有的福建柏分子身份證編碼，為福建柏構(gòu)建一個(gè)基于ISSR分析的DNA指紋圖譜；邱英雄等利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)楊梅的7個(gè)基本品種和2個(gè)優(yōu)良無(wú)性系遺傳多態(tài)性和遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，用篩選出的分辨率高和重復(fù)性最好的引物構(gòu)建了這些優(yōu)質(zhì)園林樹木品種的標(biāo)準(zhǔn)DNA電泳圖譜，使園林樹木品種或類型鑒定更準(zhǔn)確、快捷；邱英雄等人還對(duì)6種類型的樂昌含笑進(jìn)行鑒定，只需要2種引物即可區(qū)分出全部類型；繆恒彬等選用21個(gè)ISSR引物對(duì)新選育的25個(gè)小菊品種進(jìn)行擴(kuò)增，并建立了其ISSR指紋圖譜，其中一條引物ISSR 35可將25個(gè)品種完全區(qū)分開。

2問題與展望

綜上所述，ISSR分子標(biāo)記作為一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，在園林植物的遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系及分類學(xué)研究和種質(zhì)資源鑒定等方面已取得了較大進(jìn)展與廣泛的應(yīng)用。但與其它農(nóng)作物、果樹等經(jīng)濟(jì)植物相比，ISSR應(yīng)用于園林植物研究起步晚，基礎(chǔ)差，仍然存在不足，比如ISSR大部分為顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純合體與雜合體，因此進(jìn)行兩倍體或多倍體物種的種群多樣性研究時(shí)，還沒有一種合適的數(shù)學(xué)模型來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?，F(xiàn)如今，隨著人們生活水平的漸漸提高，城市的園林綠化越來(lái)越受到重視，同時(shí)人們對(duì)園林植物的重要性有了更加深刻的認(rèn)識(shí)。相信隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)憑借其簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)將越來(lái)越得到廣泛使用，特別是應(yīng)用于大批量樣品的研究，對(duì)園林植物種質(zhì)資源研究發(fā)揮更大的作用。

（收稿：2016-08-25）