枯草芽孢桿菌發(fā)酵米糠制備活性肽及其抗氧化性評價(jià)

羅斌 邱波 謝作樺

摘要[目的]研究枯草芽孢桿菌發(fā)酵米糠中蛋白多肽的水解度和抗氧化活性，為米糠的高值化綜合利用提供技術(shù)參考。[方法]以枯草芽孢桿菌為菌種，研究米糠發(fā)酵制備活性肽的條件，并對活性肽的抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)。[結(jié)果] 當(dāng)枯草芽孢桿菌接種量5%、發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度36 ℃、pH 8時(shí)，米糠發(fā)酵液中水解度較高，達(dá)到了21.74%?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵制備的米糠活性肽具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的能力。此外，米糠活性肽分子量主要分布在100～5 000 Da，富含天冬氨酸和谷氨酸，并包含了6種人體必需氨基酸。[結(jié)論]枯草芽孢桿菌發(fā)酵具有提高米糠功能特性的潛力，可為米糠的高值化利用提供參考。

關(guān)鍵詞 米糠；枯草芽孢桿菌；發(fā)酵；多肽；抗氧化性

中圖分類號(hào) TS21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）02-0122-03

Abstract[Objective] To study the degree of hydrolysis and antioxidant properties of bioactive peptide from rice bran fermented with Bacillus subtilis， which can apply a new method of comprehensive utilization of rice bran.[Method] B.subtilis was used to prepare active peptide and to evaluate the antioxidant activity of active peptide.[Result] The results showed that the degree of hydrolysis in the fermented solution was as high as 21.74%，when B.subtilis content was 5%，fermented time was 48 h，temperature was 36 ℃ and pH was 8.The peptide of rice bran showed excellent antioxidant properties including clearance abilities of DPPH radical，hydroxyl free radical and superoxide radical.The molecular weight of active peptides from rice bran was mainly distributed in 100-5 000 Da.The peptide included Asp and Glu，as well as six kinds of human essential amino acids.[Conclusion] Fermentation with B.subtilis is potential to improve the functional properties and helpful to increase the value of rice bran.

Key words Rice bran；Bacillus subtilis；Fermentation；Peptide；Antioxidant properties

我國是稻谷生產(chǎn)大國，年產(chǎn)量約為1.85億t[1]。米糠是稻谷經(jīng)碾米加工生產(chǎn)精米過程中的主要副產(chǎn)物，占稻谷整體重量的9%左右[2]。米糠含有大量的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、水溶性多糖、膳食纖維、礦物質(zhì)、維生素等[3-4]。其中，蛋白質(zhì)占米糠重量的16%～18%，其氨基酸組成接近聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）的推薦模式[5]。然而，目前我國的米糠資源利用率低，大部分仍作為飼料，甚至直接被丟棄，造成了資源的浪費(fèi)和環(huán)境污染[1]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種革蘭氏染色陽性菌，常作為生物發(fā)酵劑用于豆類蛋白質(zhì)水解制備氨基酸、多肽和氨類化合物[6-7]。然而，目前鮮有報(bào)道將枯草芽孢桿菌用于發(fā)酵米糠制備多肽。基于米糠的利用現(xiàn)狀和枯草芽孢桿菌水解蛋白的特性，筆者利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵米糠制備抗氧化肽，以期提高米糠的附加值，為米糠的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料?？莶菅挎邨U菌，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；米糠，來自當(dāng)?shù)匾患掖竺准庸S，蛋白質(zhì)含量15.78%，脂肪含量17.84%，水分含量8.24%，灰分含量9.07%。

1.1.2 主要試劑。

DPPH，希格瑪公司；鄰二氮菲、鄰苯三酚，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸等試劑，均為分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.3 主要儀器。生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵菌株種子液的制備。將2環(huán)活化的菌種接入50 mL種子培養(yǎng)基（蛋白胨1.0%，酵母浸出物0.5%，氯化鈉1.0%）中，37 ℃，120 r/min，培養(yǎng)24 h。

1.2.2 米糠發(fā)酵。

以發(fā)酵液的水解度為評價(jià)指標(biāo)，研究接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和pH對米糠發(fā)酵制備活性肽的影響。將適量種子液接種至發(fā)酵液中，在一定的溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后，取發(fā)酵液進(jìn)行水解度測定。研究某一變量時(shí)，其他因素的條件為接種量5%、發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度36 ℃、pH 8。

水解度的測定：通過溶液中游離氨基含量的測定來計(jì)算水解度，游離氨基采用TNBS法進(jìn)行測定[8]。

水解度DH=（Lt-L0）/（ Lmax-L0）×100%

式中，Lt表示發(fā)酵一段時(shí)間后發(fā)酵液中的游離氨基含量；L0表示發(fā)酵前溶液中的游離氨基含量；Lmax表示米糠中蛋白完全水解后溶液的游離氨基含量。

1.2.3 米糠活性肽的制備。

將發(fā)酵液于4 000 r/min下離心30 min，上清液再進(jìn)行過濾，凍干后即得到米糠活性肽粉末。

1.2.4 米糠活性肽抗氧化性的測定。

通過考察米糠活性肽對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，對米糠多肽的抗氧化性進(jìn)行評價(jià)，測定方法參照李艷紅[9]的報(bào)道。

1.2.5 米糠抗氧化肽氨基酸組成測定。

取10 mg大豆多肽粉末，用10 mL 6 mol/L HCl于120 ℃水解24 h，然后用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌接種量對米糠發(fā)酵產(chǎn)物水解度的影響

由圖1可見，隨著枯草芽孢桿菌接種量的增大，米糠發(fā)酵產(chǎn)物水解度先增大后趨于平緩，當(dāng)接種量達(dá)到5%后，水解度無顯著性增長，原因可能是米糠中能被利用的蛋白質(zhì)已基本上被枯草芽孢桿菌分泌的酶系水解，所以接種量相對米糠達(dá)到飽和后再進(jìn)一步增大，不會(huì)起到增加體系水解度的效果。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對枯草芽孢桿菌發(fā)酵米糠產(chǎn)物水解度的影響

由圖2可見，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，米糠發(fā)酵產(chǎn)物水解度起初顯著增長，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到48 h后，水解度達(dá)到最大值，發(fā)酵時(shí)間進(jìn)一步延長對水解度沒有明顯的影響。發(fā)酵后期水解度趨于平緩的原因可能是枯草芽孢桿菌逐步衰亡，分泌的水解酶很少；此外，發(fā)酵后期發(fā)酵體系的整體環(huán)境不利于酶的水解。

2.3 發(fā)酵溫度對枯草芽孢桿菌發(fā)酵米糠產(chǎn)物水解度的影響

由圖3可見，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液的水解度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度為36 ℃時(shí)，發(fā)酵液中水解度達(dá)到最大值。可能的原因是在此溫度下，枯草芽孢桿菌的生長速度最快，分泌的蛋白質(zhì)水解酶最多，因而米糠發(fā)酵液中蛋白降解物最多，即水解度值最大。

2.4 pH對枯草芽孢桿菌發(fā)酵米糠產(chǎn)物水解度的影響

由圖4可見，在pH 6～10時(shí)，發(fā)酵液水解度隨著pH的增加呈現(xiàn)了先增加后降低的趨勢，當(dāng)pH為8時(shí)，發(fā)酵液的水解度達(dá)到最大。此結(jié)果可能與枯草芽孢桿菌的最適生長酸堿度和蛋白酶酶解的最適pH有關(guān)。

基于上述因素對枯草芽孢桿菌發(fā)酵米糠產(chǎn)活性肽的影響結(jié)果，該試驗(yàn)選定枯草芽孢桿菌接種量5%、發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度36 ℃和pH 8用于枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備米糠活性肽的工藝條件，經(jīng)過再次試驗(yàn)，確定在此條件下，發(fā)酵液中的水解度為21.74%。此外，該試驗(yàn)在此工藝基礎(chǔ)上，對制備得到的米糠活性肽抗氧化活性和氨基酸組成進(jìn)行評價(jià)。

2.5 米糠活性肽的抗氧化活性評價(jià)

試驗(yàn)得出，米糠活性肽具有較好的抗氧化活性，其中清除DPPH自由基能力的IC50值為7.53 mg/mL，清除羥自由基能力的IC50值為6.48 mg/mL，清除超氧陰離子自由基能力的IC50值為5.74 mg/mL。因此，枯草芽孢桿菌發(fā)酵可作為一種制備米糠抗氧化肽的有效手段。

2.6 米糠活性肽的分子量分布

多肽的分子量分布是影響其活性發(fā)揮的重要因素，通過高效液相色譜確定的不同標(biāo)準(zhǔn)肽的出峰時(shí)間、面積，以分子量的對數(shù)（lnMw）對保留時(shí)間作圖得到分子量校正曲線方程，如Y=-4.376 8X+45.841，R2=0.989 2。通過高效液相色譜圖（圖5）可知，米糠活性肽分子量在1 000～5 000 Da的組分占85.30%，分子量在100～1 000 Da的組分占14.70%。

2.7 米糠活性肽的氨基酸組成

多肽的氨基酸組成和含量是影響其活性發(fā)揮的重要因素，如Adebiyi等[10-11]研究結(jié)果表明，米糠蛋白酶解物的氨基酸組成與其抗氧化活性有很大的相關(guān)性；劉志國等[12]則報(bào)道米糠ACE抑制肽活性可能與C端的苯環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān)。該試驗(yàn)采用枯草芽孢桿菌制備的米糠活性肽富含天冬氨酸和谷氨酸。此外，米糠活性肽氨基酸組成豐富，含有6種人體必需氨基酸，分別為蛋氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸（表1）。由此可見，米糠活性肽是一種良好的營養(yǎng)補(bǔ)充劑。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)研究了枯草芽孢桿菌發(fā)酵因素對發(fā)酵液水解度

的影響，隨著接種量和發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液水解度先增加后趨于平緩；隨著發(fā)酵溫度和pH的增加，發(fā)酵液水解度呈先增加后減少的趨勢。在枯草芽孢桿菌接種量5%、發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度36 ℃和pH 8的發(fā)酵條件下，發(fā)酵液水解度達(dá)到了21.74%?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵制備的米糠活性肽分子量主要分布在100～5 000 Da，富含天冬氨酸和谷氨酸，包含了6種人體必需氨基酸，且具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的能力，是一種頗具潛力的活性肽營養(yǎng)補(bǔ)充劑。

參考文獻(xiàn)

[1] 夏寧.噴射蒸煮制備米糠、碎米蛋白及其功能性研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2012.

[2] 孫德明.米糠綜合利用的開發(fā)研究[J].中小企業(yè)管理與科技，2008（12）：201-202.

[3] 李璐，李宗軍.新型米糠功能食品的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2011（7）：105-107.

[4] PARK J W，JANG E Y，KIM J Y，et al.Effects of visible light irradiation on the oxidative stability in rice bran[J].Journal of cereal science，2013，58（1）：178-181.

[5] 郭延熙.米糠抗氧化肽的酶法制備及其特性研究[D].長沙：中南林業(yè)科技大學(xué)，2013.

[6] 張友維.枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生粕制備抗氧化肽的研究[D].無錫：江南大學(xué)，2012.

[7] CHUNG Y C，CHANG C T，CHAO W W，et al.Antioxidative activity and safety of the 50 ethanolic extract from red bean fermented by Bacillus subtilis IMRNK1[J].Journal of agricultural and food chemistry，2002，50（8）：2454-2458.

[8] JAMDAR S N，RAJALAKSHMI V，PEDNEKAR M D，et al.Influence of degree of hydrolysis on functional properties，antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate[J].Food chemistry，2010，121（1）：178-184.

[9] 李艷紅.鷹嘴豆蛋白酶解物的制備及其抗氧化肽的研究[D].無錫：江南大學(xué)，2008.

[10] ADEBIYI A P，ADEBIYI A O，YAMASHITA J，et al.Purification and characterization of antioxidative peptides derived from rice bran protein hydrolysates[J].Europe food research technology，2009，228（4）：553-563.

[11] ADEBIYI A P，ADEBIYI A O，OGAWA T，et al.Purification and characterisation of antioxidative peptides from unfractionated rice bran protein hydrolysates[J].International journal of food science and technology，2008，43（1）：35-43.

[12] 劉志國，吳瓊，呂玲肖，等.酶解米糠蛋白分離提取ACE抑制肽及其結(jié)構(gòu)研究[J].食品科學(xué)，2007，28（3）：223-227.