微生物發(fā)酵法制備γ—氨基丁酸的研究進展

楊宏芳 朱宏陽 李泳寧 王金海 林偉鈴

摘要 γ-氨基丁酸（GABA）是一種廣泛存在于動植物體內(nèi)的非蛋白質(zhì)天然氨基酸，具有重要的生理活性，在醫(yī)療、食品加工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。論述了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GABA及乳酸菌的誘變選育和發(fā)酵條件優(yōu)化等方面的研究進展。

關(guān)鍵詞 γ-氨基丁酸；乳酸桿菌；研究進展

Research Progress on the Preparation of γ-aminobutyric Acid by Microbial Fermentation

YANG Hong-fang，ZHU Hong-yang*，LI Yong-ning et al （Fujian Health College，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350101 ）

Abstract γ-aminobutyric acid is one of non-protein natural amino acids which widely exists in animals and plants.GABA has wide application in the medical and food industries due to its important physiological activity.This paper discusses the GABA production by microbial fermentation and the research progress of mutation breeding of lactic acid bacteria and its optimization of culture medium.

Key words γ-aminobutyric acid；Lactic acid bacteria；Research progress

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA，又稱氨酪酸），分子式為C4H9NO2，分子量103.12，是廣泛存在于動物、植物和微生物中的一種非蛋白質(zhì)天然氨基酸[1]。GABA是植物細胞內(nèi)自由氨基酸的重要組分，當(dāng)細胞受到損傷、冷熱刺激、組織缺氧時，植物體內(nèi)GABA含量快速增加。此外，GABA還是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。研究表明，GABA對哺乳動物具有增進食欲、促進消化、降血壓、改善睡眠、鎮(zhèn)靜、抗心率失常、調(diào)節(jié)激素分泌、促進生殖等功能[2]。其在醫(yī)療、食品加工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，其市場需求量日益增加，由于GABA天然含量很低，單純依靠天然物質(zhì)提取遠遠不能滿足市場的需求[3]，因此有必要研究人工制備GABA的方法。

1 GABA的制備方法

目前GABA的制備方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法，生物合成法又分為植物富集法和微生物發(fā)酵法。

1.1 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法多以γ-氯丁氰和鄰苯二甲酰亞氨鉀或其他化合物于高溫下反應(yīng)，并通過結(jié)晶分離提取獲得GABA[4]?；瘜W(xué)合成法雖已應(yīng)用于生產(chǎn)，但其存在原料價格高昂、毒性大，反應(yīng)條件劇烈、設(shè)備成本高，易產(chǎn)生副產(chǎn)物、分離效果差，安全性能差易造成環(huán)境污染等問題。新報道的合成方法雖有許多改善，但流程步驟多，要實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還需進一步改進工藝流程。

1.2 生物合成法

1.2.1 植物富集法。植物富集法有2條途徑：一是轉(zhuǎn)化途徑（主要途徑），谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化轉(zhuǎn)化合成GABA，通過外界條件刺激植物組織產(chǎn)生應(yīng)激代謝而生成；二是多胺降解，植物體內(nèi)的多胺在多胺氧化酶的作用下，氧化脫氨形成H2O2、氨和4-氨基丁醛，4-氨基丁醛脫水后生成1-吡咯啉，經(jīng)吡咯啉脫氫酶作用下生成GABA[5]。與化學(xué)合成法相比，植物富集法操作簡單易行，但由于其產(chǎn)率低、分離提取困難而導(dǎo)致其成本居高不下，在工業(yè)化生產(chǎn)中存在較大的局限性。

1.2.2 微生物發(fā)酵法。

微生物發(fā)酵法主要是利用微生物細胞中谷氨酸脫羧酶將L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA，已被用于GABA生產(chǎn)的菌株有大腸桿菌（Escherichia coli） [6]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） [7]、曲霉（Aspergillus） [8]、酵母菌（Saccharomyces） [9]、乳酸菌（Lactobacillus）[10]等。這類微生物具有生長速度快、周期短、條件溫和、代謝簡單及分布廣泛的優(yōu)點，以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GABA不受空間、環(huán)境和資源的限制，有利于規(guī)?；?、工業(yè)化生產(chǎn)，因此此法制備GABA已成為近年來生產(chǎn)GABA的研究熱點。

2 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GABA

目前，用于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GABA菌種有酵母菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、曲霉菌、乳酸菌等。

2.1 酵母菌發(fā)酵法

酵母菌是單細胞真核生物，被廣泛應(yīng)用于釀酒行業(yè)，是非常重要的微生物資源。近來的一些研究發(fā)現(xiàn)酵母菌具有谷氨酸脫羧酶活性，因此酵母菌可被應(yīng)用于生產(chǎn)GABA。如Takahashi等[11]選育獲得Saccharomyces cerevisiae K701的突變株GAB7-2，GABA在發(fā)酵液中濃度為0.043 g/L。趙國群等[12]從梨果實篩選獲得S.cerevisiae KS45菌株于30 ℃下發(fā)酵10 d可獲得2.427 g/L的GABA。肖婧等[13]從新疆特色食品中篩選獲得一株有孢漢遜酵母菌株XYN019，對其進行紫外誘變選育，33.95 ℃下發(fā)酵49.17 h，GABA產(chǎn)量可達4.926 g/L。

2.2 大腸桿菌發(fā)酵法

生物法制備GABA的早期研究中，以大腸桿菌發(fā)酵法為主。如趙景聯(lián)[14]采用海藻酸鈣包埋法固定E.coli，采用柱式反應(yīng)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化1%的谷氨酸溶液產(chǎn)GABA，其轉(zhuǎn)化率可達85%；陳蔚青等[15]以海藻酸鈉與明膠協(xié)同包埋E.coli細胞，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件后，谷氨酸轉(zhuǎn)化率可達98.7%；楊帆[16]采用先培養(yǎng)E.coli AS1.505細胞，然后再投入谷氨酸的方式獲得60 g/L的GABA，轉(zhuǎn)化率為100%；Plokhov等[6]利用有高谷氨酸脫羧酶（GAD）活性的重組E.coli GADK10催化轉(zhuǎn)化谷氨酸合成GABA，產(chǎn)量高達280～300 g/L。雖然利用E.coli可實現(xiàn)高效制備GABA，但由于E.coli在食品工業(yè)中存在著較大的安全隱患，因此在食品工業(yè)中很少采用E.coli制備GABA，一般僅用于化工原料生產(chǎn)。

2.3 枯草芽孢桿菌發(fā)酵法

枯草芽孢桿菌目前在生物法制備GABA中的研究相對較少，但其作為一種生物安全性較高的表達系統(tǒng)，在構(gòu)建重組全細胞催化生產(chǎn)GABA的研究日漸增多。如莫征杰等[17]利用從植物乳桿菌中得到的GAD （Glutamate decarboxylase）基因，構(gòu)建質(zhì)粒pMA5/lapgad，在B.subtilis W B600系統(tǒng)中進行異源重組表達，胞內(nèi)酶活達0.35 U/mL，為全細胞合成GABA提供指導(dǎo)意義；丁偉等[18]構(gòu)建了一株產(chǎn)GAD的重組枯草芽孢桿菌，并對其發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，在優(yōu)化條件下，GAD酶活達0.413 U/mL；由于枯草芽孢桿菌中無磷酸吡哆醛的再生途徑而使得轉(zhuǎn)化效率低下。張六六等[19]將GAD基因（gadA）和磷酸吡哆醛再生基因（pdxH）在質(zhì)粒pHT01上串聯(lián)，構(gòu)建B.subtilis 168/pHT01-gadA-pdxH，通過增加輔酶磷酸吡哆醛的量而提高菌株對底物谷氨酸的轉(zhuǎn)化率，在最優(yōu)條件下，該菌株催化24 h，GABA可達327.00 g/L。

2.4 曲霉菌發(fā)酵法

曲霉是一種腐生真菌，可耐酸性，曲霉含有豐富的酶系統(tǒng)，可進行多種生理生化反應(yīng)，GABA是其眾多代謝產(chǎn)物之一。用于生產(chǎn)GABA的曲霉菌主要為紅曲霉。如胡珊等[20]從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選獲得20株紅曲霉菌株，其中MXL-8是高產(chǎn)GABA的，經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)基后搖瓶發(fā)酵6 d獲得約22.373 g/L的GABA；秦江輝等[21]對Monascu 3.4450進行60Co誘變選育，獲得8株GABA產(chǎn)量較高的菌株，其中25號菌株GABA產(chǎn)量達5.255 mg/g；張慶慶等[8]利用M.pilosus ZL307進行固態(tài)發(fā)酵豆渣獲得417.00 mg/kg的GABA。然而，目前曲霉菌生產(chǎn)GABA的效率很低，工業(yè)化難度還很大。

2.5 乳酸菌發(fā)酵法

乳酸菌作為一種食品安全級細菌被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)，目前國內(nèi)外已有多株GABA高產(chǎn)乳酸菌株的報道。如由Yokoyama S等[22]從酒糟中篩選獲得的L.brevis IFO12005，發(fā)酵2 d，GABA可達6.300 g/L；繆存影等[23]從酸菜中篩選獲得一株高產(chǎn)GABA乳酸菌，靜置發(fā)酵可獲13.450 g/L的GABA；由Kim等[24]分離獲得的L.brevis GABA100培養(yǎng)12 d后，GABA含量為26.900 g/L；周青等[25]從泡菜中篩選獲得的L.plantarum可產(chǎn)1.260 g/L的GABA。

3 產(chǎn)GABA乳酸菌株誘變選育及發(fā)酵條件優(yōu)化

目前，生產(chǎn)GABA的研究主要聚焦于乳酸菌，然而國內(nèi)外學(xué)者在研究中分離獲得的不同乳酸菌其產(chǎn)GABA的能力各不相同。為了獲得GABA的高產(chǎn)菌株，國內(nèi)外學(xué)者對乳酸菌株的誘變選育及發(fā)酵條件優(yōu)化等進行了深入的研究。

3.1 乳酸菌株誘變選育

從自然界直接分離獲得的野生型菌株積累產(chǎn)物的能力普遍較低，因此無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。通過誘變育種的方法提升菌株的生產(chǎn)能力，是發(fā)酵工業(yè)中實現(xiàn)生產(chǎn)能力提升的最有效途徑。在微生物誘變育種中，常用的誘變育種方法有物理誘變、化學(xué)誘變及生物誘變。

3.1.1 物理誘變。物理誘變中常用的誘變劑有紫外線（UV）、γ-射線、X射線及N+離子束注入等。劉婷婷等[26]利用紫外誘變處理L.plantarum LP-GB 01后采用GABA梯度平板選育獲得LP-GB 01-21，GABA產(chǎn)量可達51.900 g/L，比出發(fā)株提高了55.39%；夏江等[27]將L.brevis hjxj-01先用紫外誘變處理后再用60Co進行誘變處理，獲得hjxj-08119，GABA產(chǎn)量可達17.000 g/L，比出發(fā)株提高了142.90%；張穎等[28]利用30 keV的N+離子束注入處理L.brevis TCCC13007，篩選獲得S2菌株，優(yōu)化培養(yǎng)基中GABA產(chǎn)量達35.000 g/L，提升了31.00%。

3.1.2 化學(xué)誘變?；瘜W(xué)誘變劑種類繁多，在微生物育種中常用的有烷化劑、堿基類似物、脫氨基、金屬鹽等，其中最常用的為烷化劑，如亞硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）等?；瘜W(xué)誘變劑誘變效果不一，不同菌株之間對誘變劑的敏感度不同，在育種實踐中常采用復(fù)合誘變方式來提升菌株突變率。如李秀涼等[29]對乳酸片球菌采用UV和NTG復(fù)合誘變篩選獲得突變株UN-27，GABA平均產(chǎn)量為5.020 g/L，與出發(fā)菌株相比提升472.00%；葛菁萍等[30]將短乳桿菌HDBR-02經(jīng)UV和NTG復(fù)合誘變后獲得突變株F11，產(chǎn)量達8.900 g/L，與出發(fā)菌株相比提高了300.00%。

從上述研究中可以看出，誘變育種雖然可以提升菌株產(chǎn)GABA的能力，但誘變育種中有利變異較少，誘變方向和性質(zhì)較難控制，且易產(chǎn)生回復(fù)突變，篩選工作量大，想要大幅提高GABA產(chǎn)量，還需對篩選獲得的突變株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化才能進一步提高GABA的產(chǎn)率。

3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

發(fā)酵條件的優(yōu)化是為了找出適合不同菌種的最適發(fā)酵條件，得出最優(yōu)生產(chǎn)GABA的方案，從而可以降低生產(chǎn)成本。發(fā)酵條件優(yōu)化一般包括營養(yǎng)條件如碳源、氮源和無機鹽組成的優(yōu)化，環(huán)境因素如發(fā)酵溫度、pH、通風(fēng)量等因素的優(yōu)化。

2010年，范杰等[31]以分離自泡菜的短乳桿菌為研究對象，對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)化后發(fā)酵液中GABA含量達14.150 g/L。王興潔等[32]從四川泡菜水中分離獲得1株植物乳桿菌W1-9，對其以MRS為基礎(chǔ)的GABA發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，以黃瓜汁為發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH 5.5，底物谷氨酸鈉添加量12.00 g/L，菌液接種量1.20%，該條件下GABA產(chǎn)量達7.620 g/L，比初始2.180 g/L提高249

.00%。尹然等[33]以植物乳桿菌Lb-17為出發(fā)菌株，利用單因素試驗和Box-Behnken響應(yīng)面試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)化后的培養(yǎng)基為葡萄糖12.00 g/L、酵母粉18.00 g/L、Ca2+ 55.00 mmol/L、Mg2+ 60.00 mmol/L、L-谷氨酸鈉26.00 g/L，優(yōu)化后GABA產(chǎn)量達8.037 g/L，較優(yōu)化前5.490 g/L提高150.00%。

發(fā)酵罐工藝優(yōu)化將有助于提高GABA的產(chǎn)量。葉硯等[34]在響應(yīng)面優(yōu)化的基礎(chǔ)上對工藝條件進行了優(yōu)化，最優(yōu)條件為34 ℃，pH 5.5，通風(fēng)量120 L/h，GABA產(chǎn)量達9.180 g/L。楊帆[16]對E.coli AS1.505在發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)并優(yōu)化了培養(yǎng)條件：pH為7.0，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，通風(fēng)量為1.5 m3/（m3·min），葡萄糖起始濃度為10.70 g/L，在培養(yǎng)2 h后以恒速流加葡萄糖至終濃度為30.83 g/L，菌體濃度在11 h達到最大值18.100 g/L，再加入88.20 g/L的L-谷氨酸轉(zhuǎn)化16 h后得到60.00 g/L的GABA，其轉(zhuǎn)化率達到100%。

4 展望

GABA作為一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其參與多種代謝活動，具有延緩大腦衰老、降血壓、降血氨、治療神經(jīng)疾病、抗心律失常等多種生理功能，其作為一種全新的活性因子廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品領(lǐng)域。隨著人們對GABA認識的深入，對GABA的需求日益增長，開發(fā)食品安全級的GABA并降低生產(chǎn)成本已成為亟待解決的問題，GABA的工業(yè)化生產(chǎn)將有廣闊的發(fā)展前景。

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