米飯中蠟樣芽孢桿菌生長模型建立的研究

黃丹陽+曹慧+徐斐+袁敏+宇盛好+彭少杰

摘要：本研究首先考察了溫度（10、15、20、25、30、34、37和43 ℃）對米飯中蠟樣芽孢桿菌生長的影響，并采用SGompertz和SLogistic模型對不同溫度下蠟樣芽孢桿菌的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合；在此基礎(chǔ)上，以擬合度（R2）、準(zhǔn)確因子（Af）和偏差因子（Bf）為指標(biāo)，比較并建立了米飯中蠟樣芽孢桿菌的二級生長模型。結(jié)果表明，SGompertz模型能更好的擬合米飯中蠟樣芽孢桿菌在不同溫度下的生長數(shù)據(jù)，因此選擇其作為蠟樣芽孢桿菌在米飯中的一級生長模型。采用平方根模型建立的米飯中蠟樣芽孢桿菌二級生長模型的Af值分別為1.12和1.14，Bf值分別為0.99和1.03，擬合度分別為0.9537和0.8503；采用二次多項式模型建立的二級生長模型的Af值分別為1.24和1.11，Bf值分別為0.92和0.92，擬合度分別為0.9550和0.9462，可見二次多項式模型能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測米飯中蠟樣芽孢桿菌的生長狀況，模型具有可靠性。

關(guān)鍵詞：蠟樣芽胞桿菌；米飯；一級生長模型；二級生長模型

Study on predictive models for the growth of Bacillus cereus in cooked rice

HUANG Dan-yang1， CAO Hui1， XU Fei1*， YUAN Min1， YU Sheng-hao2， PENG Shao-jie2*

（1.School of Medical Instrument and Food Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China；2.Shanghai Center for Adverse Drug and Medical Device Reaction Monitoring Shanghai 200233， China）

Abstract： The paper is designed to study the effects of temperature （10， 15， 20， 25， 30， 34， 37 and 43 ℃） on the growth of Bacillus cereus in rice.And then the SGompertz and SLogistic models were selected as the primary growth models to fit the growth curve of Bacillus cereus in cooked rice with variable storage temperatures.Using the fitness （R2）， accuracy factor （Af） and deviation factor （Bf） as evaluation index， quadratic polynomial model and square root model were selected further to fit the secondary growth models of Bacillus cereus in cooked rice.The results showed that the SGompertz model could well describe the growth of Bacillus cereus at different temperature， and therefore it was chosen as the primary growth model of Bacillus cereus in rice.For the developed square root model， Af was 1.12 and 1.24， Bf was 0.99 and 1.03， R2 values were 0.9537 and 0.8503； respectively. For the developed quadratic polynomial model， Af was 1.24 and 1.11， Bf was 0.92 and 0.92， R2 values were 0.9550 and 0.9462； respectively. The results show that the quadratic polynomial model can well predict the growth of Bacillus cereus in rice.

Keywords：Bacillus cereus； cooked rice； primary growth model； secondary growth model

中圖分類號：文獻(xiàn)標(biāo)志碼：文章編號：

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）在自然界中普遍存在，其最適生長溫度為25℃～37℃，最適生長pH值范圍為4.3～9.3[1]。蠟樣芽孢桿菌可引起嘔吐型和腹瀉型食物中毒。嘔吐型食物中毒主要由低分子量的嘔吐毒素（Cereulide）引起[2]，該毒素常在米飯類食品中被檢出，耐熱，耐蛋白酶水解酶，對酸堿穩(wěn)定，高溫121℃處理30 min 仍不失活[3-4]。腹瀉型食物中毒主要由腹瀉毒素引起，能導(dǎo)致腹瀉型胃腸炎。蠟樣芽孢桿菌主要以孢子狀態(tài)廣泛存在于自然界和食品中，尤其是谷物等淀粉含量高的食品[5]。呂榮[6]統(tǒng)計分析了近10年來（1993～2002年）國內(nèi)報道的47起蠟樣芽孢桿菌食物中毒事件，發(fā)現(xiàn)被污染的食品主要為剩米飯（44.6%）和開水泡飯（17.0%）。中國CDC《食源性疾病監(jiān)測工作手冊》將米飯和米粉中的蠟樣芽孢桿菌作為重點監(jiān)測項目。近年來，由蠟樣芽孢桿菌導(dǎo)致的食物中毒事件呈增加的趨勢[7]。米飯作為我國居民的主食是蠟樣芽孢桿菌的重要污染源，然而對米飯中蠟樣芽孢桿菌生長預(yù)測模型的研究較少。因而，本研究首先考察了溫度（10、15、20、25、30、34、37和43 ℃）對米飯中蠟樣芽孢桿菌生長的影響，并采用SGompertz和SLogistic模型對不同溫度下蠟樣芽孢桿菌的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合；在此基礎(chǔ)上，以擬合度、準(zhǔn)確因子和偏差因子為指標(biāo)，比較并建立了米飯中蠟樣芽孢桿菌的二級生長模型，研究結(jié)果可為米飯中蠟樣芽孢桿菌的安全控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器設(shè)備

米飯，取自集體食堂；蠟樣芽胞桿菌菌株（CMCC（B）66301），購于上海復(fù)祥生物科技有限公司；甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂基礎(chǔ)（MYP）、多粘菌素B、50%卵黃乳液、腦心浸出液肉湯（BHI）、無菌均質(zhì)袋購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SW-CJ-1FD型潔凈工作臺，購自于蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，購自于上海比朗儀器有限公司；SCIENTZ-09無菌均質(zhì)器，購自于寧波新芝生物科技股份有限公司；YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，購自于上海博迅實業(yè)有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1蠟樣芽孢桿菌的接種、培養(yǎng)及計數(shù)

將蠟樣芽孢桿菌接種到BHI營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔一段時間取出在600 nm下測吸光值，同時用平板計數(shù)法計數(shù)，建立吸光度與細(xì)菌數(shù)量之間的線性關(guān)系。將米飯按無菌操作裝入無菌均質(zhì)袋，每袋約為10g；用移液槍吸取1 mL稀釋后的菌懸液均勻滴至米飯表面，控制初始接種量為103 CFU/g；將接種后的米飯分別置于不同溫度（10、15、20、25、30、34、37和43 ℃）下進(jìn)行培養(yǎng)[8]；根據(jù)不同溫度下蠟樣芽胞桿菌的生長速率，每隔一段時間取樣，并按照GB 4789.14-2014《食品微生物學(xué)檢驗蠟樣芽胞桿菌檢驗》中的平板計數(shù)法測定樣品中的菌落數(shù)。

1.3.2 米飯中蠟樣芽孢桿菌一級生長模型的建立

采用SGompertz模型[9]（式1）和SLogistic模型[9]（式2）對不同溫度下米飯中蠟樣芽胞桿菌的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，并分別計算出相應(yīng)的最大比生長速率（μmax）和遲滯期（λ）。

lg（Nt/N0）=a×exp{-exp[-k×（t-xc）]}（1）

lg（Nt/N0）=a×{1+exp[-k×（t-xc）}（2）

式中：Nt 、N0分別表示在時間t時和初始時間的微生物的數(shù)量（cfu/g）； a為最大菌數(shù)Nmax與初始菌數(shù)N0的差值；xc為達(dá)到相對最大生長速率所需的時間；k為在時間xc的相對生長速率。

1.3.3 米飯中蠟樣芽孢桿菌二級生長模型的建立

平方根模型[10] （式3、4）和二次多項式模型[11] （式5）常用來描述溫度對微生物生長的影響。因而，本研究基于一級生長模型中所獲得的米飯中蠟樣芽孢桿菌的μmax和λ值，選用這兩種模型對米飯中蠟樣芽孢桿菌的二級生長模型進(jìn)行擬合。

1.3.4 模型的驗證

采用Bf （式6）和Af （式7）對所建立的二級模型進(jìn)行驗證。Bf和Af被認(rèn)為是驗證模型可靠度的有效工具[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 米飯中蠟樣芽孢桿菌的一級生長模型

本研究首先考察了溫度（10、15、20、25、30、34、37和43 ℃）對米飯中蠟樣芽孢桿菌生長的影響，并采用SGompertz和SLogistic模型對不同溫度下蠟樣芽孢桿菌的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。由兩種模型擬合的米飯中蠟樣芽孢桿菌的生長曲線如圖1-8所示，相應(yīng)的擬合參數(shù)如表1所示。結(jié)果表明，由SGompertz和SLogistic模型擬合的米飯中蠟樣芽孢桿菌在不同溫度下的一級生長模型的R2值并無顯著性差異（P>0.05）。SGompertz方程是一種雙指數(shù)函數(shù)，常用于擬合微生物的生長，且其對米飯中蠟樣芽孢桿菌生長的擬合值均略高于SLogistic模型，因而選擇其作為不同溫度下米飯中蠟樣芽孢桿菌的一級生長模型。

根據(jù)SGompertz模型擬合的米飯中蠟樣芽胞桿菌在不同溫度的最適生長模型見表2，由此計算的μmax和λ見表3。從結(jié)果可以看出，隨著溫度的增加，米飯中蠟樣芽胞桿菌的最大比生長速率呈上升的趨勢，反之遲滯期呈下降的趨勢。

2.2米飯中蠟樣芽胞桿菌的二級生長模型

根據(jù)SGompertz模型計算得到的米飯中蠟樣芽胞桿菌在不同溫度下的μmax和λ，采用平方根模型和二次多項式模型分別擬合了蠟樣芽胞桿菌在米飯中的二級生長模型，結(jié)果如圖9和圖10所示。

由圖9可見，采用平方根模型（圖9a）擬合的蠟樣芽孢桿菌生長溫度與其μmax關(guān)系的R2為0.9537，采用二次多項式模型（圖9b）擬合的R2為0.9550，兩者的擬合結(jié)果非常接近。由圖10可見，采用二次多項式模型（圖10a）擬合的蠟樣芽孢桿菌生長溫度與其λ關(guān)系的R2為0.8503，二次多項式模型（圖10b）擬合的R2為0.9462。由此可見，二次多項式模型的擬合結(jié)果優(yōu)于平方根模型的擬合結(jié)果，因此二次多項式模型可以較好的預(yù)測蠟樣芽孢桿菌生長溫度與λ和μmax的關(guān)系。

2.3模型驗證

Bf和Af是非常有價值的模型驗證工具，因而本研究采用Bf和Af對所建立的平方根模型和二次多項式模型進(jìn)行驗證，結(jié)果如表4所示。

由表4可見，在對溫度與μmax和λ之間的關(guān)系進(jìn)行擬合時，采用平方根模型建立的米飯中蠟樣芽孢桿菌二級生長模型的Af值分別為1.12和1.14，Bf值分別為0.99和1.03，擬合度分別為0.9537和0.8503；采用二次多項式模型建立的米飯中蠟樣芽孢桿菌二級生長模型的Af值分別為1.24和1.11，Bf值分別為0.92和0.92，擬合度分別為0.9550和0.9462。Ross等研究表明[14-15]，Af和Bf值越接近于1，所建模型的可信度越高，如果Bf值在0. 70～0. 90或1. 06～1. 15之內(nèi)，Af值在1.0-1.9之內(nèi)所建的模型均可被接受[16]。綜合所建二級模型的R2、Bf及Af值，本研究選擇二次多項式模型作為米飯中蠟樣芽孢桿菌的二級生長模型。

3結(jié)論

本文研究了10、15、20、25、30、34、37和43 ℃條件下米飯中蠟樣芽孢桿菌的生長規(guī)律，建立了米飯中蠟樣芽孢桿菌的一級生長模型和二級生長模型。對于一級生長模型，采用SLogistic模型和SGompertz模型對蠟樣芽孢桿菌的生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。此兩種模型為預(yù)測微生物學(xué)中最常見且使用最普遍的兩種模型。在建模后，通過對兩種模型擬合度等相關(guān)因子進(jìn)行對比，得到擬合度較高的模型（SGompertz模型）作為本文的一級生長預(yù)測模型。SGompertz方程是一種雙指數(shù)函數(shù)，常用于擬合微生物的生長，且其對米飯中蠟樣芽孢桿菌生長的擬合值均略高于SLogistic模型，因而選擇其作為不同溫度下米飯中蠟樣芽孢桿菌的一級生長模型，表明實驗所得數(shù)據(jù)與實際生長情況更為符合，模型更為可靠。通過R2、Bf及Af的比較，二次多項式模型作為二級生長模型能夠更準(zhǔn)確、更可靠地預(yù)測米飯中蠟樣芽孢桿菌的生長狀況。

蠟樣芽孢桿菌分布廣泛，常見于土壤、灰塵和污水中，在許多植物性食品和生熟食品中也十分常見，因此很容易引起食物中毒。由一級模型和二級模型的擬合結(jié)果可知，NaCl濃度對蠟樣芽孢桿菌的生長有影響。除蒸煮米飯外，若有需要添加NaCl作為添加劑調(diào)節(jié)食物風(fēng)味的產(chǎn)品，則需合理控制食品中NaCl的添加量，以便控制蠟樣芽孢桿菌的生長。

此外，米飯蒸煮時，應(yīng)盡量控制操作過程中的環(huán)境溫度。剛蒸煮出來的米飯溫度一般較高在50℃以上，此時一般沒有蠟樣芽孢桿菌的存在。但在之后的儲存過程中，環(huán)境溫度逐漸降低，若處理措施不當(dāng)或衛(wèi)生控制不嚴(yán)格等，則很容易滋生微生物。并且如果保存時間較長環(huán)境溫度較高，則蠟樣芽孢桿菌的芽孢有可能萌發(fā)，所以應(yīng)盡量縮短米飯蒸煮后的保存時間，并且盡量降低儲藏的環(huán)境溫度。

本試驗結(jié)果可作為米飯中蠟樣芽孢桿菌定量風(fēng)險評估的參考，并為制定米飯中蠟樣芽孢桿菌限量標(biāo)準(zhǔn)和風(fēng)險管理措施等提供科學(xué)依據(jù)。

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